专利名称：一种建立血管性痴呆大鼠模型的新型方法
技术领域：
本发明涉及一种建立血管性痴呆大鼠模型的新型方法，具体地说是一种采用水胺硫磷对SD大鼠进行长期灌胃，通过水胺硫磷对SD大鼠血管及大脑神经组织造成慢性损伤以建立血管性痴呆大鼠模型。
背景技术：
VD (Vascular Dementia，VD)是由于一系列血管损伤因素导致脑组织损害而引起的痴呆综合症。以记忆力受损、认知功能下降为主，或伴有语言功能下降以及情感、人格障碍为主要临床表现的一组神智异常症候群。
在欧美国家中，VD占老年痴呆总数的15% ；在中国、日本等亚洲国家，VD占老年痴呆总数的50%。目前，我国的VD患病率为324/10万，彡65岁人群中VD的患病率为1. 3%。 并且，随着人口老龄化和血管性疾病的发病率增高，VD的发病率呈上升趋势。现代医学研究认为，VD为多因素损伤性疾病，其病因可能包括高血压、糖尿病、动脉硬化、冠心病、脑梗塞、脑缺血再灌注损伤等，其诱因可能包括吸烟、饮酒、环境污染、电离辐射等。遗憾的是，迄今为止尚未确定VD发病的真正原因，更未找到理想的抗VD药物。因此，无论从VD的病因或是诱因入手，找到正确的治疗靶点，开发理想的干预药物，将对保障人类健康及提高老年人生活质量做出贡献！动物模型的建立是研究疾病发病机理的必要条件。目前，常见的VD模型建立方法包括①血管外阻断法，如四血管阻断法(four vessel occlusion，4V0)、三血管阻断法 (three vessel occlusion, 3V0)、两血管阻断法(two vessel occlusion, 2V0)；②血管内栓法；③大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCA0)；④高血压脑卒中自发大鼠动物模型(stroke—prone spontaneously hypertensive rats, SPSHR)；(5)去大脑皮层VD动物模型；⑥立体定向光化学诱导脑梗死模型；⑦脑内注射内皮素法。
虽然VD动物模型的建立方法较多，但每种方法都是从模拟人类VD发病的某一个侧面来完成的，与临床实际情况尚有一定偏离，主要问题有以下几点①目前VD模型都是建立在有创伤的基础之上，大鼠本身耐受性差，创伤性模型导致大鼠死亡率高；②VD病因复杂，影响因素较多，发病时程较长。而目前的VD模型建立的时间一般较短，不能完全反应实际情况；③创伤本身对机体造成的应激对VD模型的稳定性有一定的影响。因此，建立一种长期、慢性的无创性VD模型对于研究VD的发病机理很有必要！一些社会调查数据显示，长期、低剂量接触有机磷农药能够导致记忆力受损、认知及语言功能下降、情感障碍等症状。①ffesseling C对157名长期暴露于有机磷环境中的香蕉工人进行精神心理数字编码分析，结果显示，长期、低剂量接触有机磷农药造成明显的语言功能下降及人格障碍(Wesseling C, Keifer M, Ahlbom A, McConnell R, Moon JD, Rosenstock L, Hogstedt C. Long-term neurobehavioral effects of mild poisonings with organophosphate and n—methyl carbamate pesticides among banana workers. Int J Occup Environ Health, 2002. ) ；(2) Stephens R 对 146 名长期暴露于有机磷农药环境中的羊毛工人进行神经心理学调查，结果显示，长期、低剂量接触有机磷农药造成明显的短期记忆力受损及语言功能下降，并出现认知、情感障碍等症状(St印hens R, Spurgeon A, Calvert IAj Beach J，Levy LSj Berry H，Harrington JM. Neuropsychological effects of long-term exposure to organophosphates in sheep dip. Lancet, 1995. )0 通过上述调查我们猜测，“长期、低剂量接触有机磷”与“VD”存在一定的因果关系。于是，我们实验室于2010年7月-2011年4月开展了长期、低剂量接触水胺硫磷诱发SD大鼠产生 VD的动物实验。通过水胺硫磷对SD大鼠的急性、慢性毒理实验，确定水胺硫磷的灌胃浓度为0. 5mg/kg，灌胃容量为3ml/kg，灌胃频率为隔日1次，灌胃周期为M周。对照组采用2V0 法制备VD大鼠模型。采用大鼠跳台试验、避暗试验及Morris水迷宫试验(Morris Water Maze，MWM)来判断大鼠记忆功能，并通过血管功能学实验、血管及大脑神经元形态学实验来判断VD大鼠模型是否成功。发明内容
本发明提供了一种建立VD大鼠模型的新型方法。
本发明提供了一种无创性建立VD大鼠模型的新型方法。
本发明提供了一种利用水胺硫磷灌胃的方法建立VD大鼠模型。
本发明提供的SD大鼠为清洁级、健康SD大鼠，鼠龄为6周龄，性别为雄性，体质量为 180 220g。
本发明提供的水胺硫磷灌胃浓度为0. 5mg/kg，灌胃容量为3ml/kg，灌胃频率为隔日1次，灌胃周期为M周。
本发明应用的水胺硫磷可以直接购买，按照实际浓度进行稀释。
本发明SD大鼠生长环境要求为动物房温度为18 22°C，相对湿度为40 70%， 气流速度为0. 1 0. 2米/秒，换气次数为30次/小时，环境洁净度为10000 100000级， 三级定向控制空气压差为0 20%，自动定时器控制光照周期(08 00 20 00为光照期， 20 00 08 00为黑暗期)，常规大鼠饲料及净化自来水饲养。
本发明采用的灌胃方法是常用的大鼠灌胃法，灌胃针经大鼠口角插入口腔，轻压大鼠舌根部，大鼠自主吞咽，操作人员顺势将灌胃针送入大鼠胃中，将药物推入。
经跳台试验、避暗试验、Morris水迷宫试验、血管功能学实验及形态学实验证明， 该方法建立的VD大鼠模型与传统的有创性方法制备的VD大鼠模型没有明显差异，说明模型成功。
图1水胺硫磷诱发VD模型大鼠跳台、避暗试验潜伏期结果(—± s)(与阳性对照组比较，*P<0. 05 ；与正常对照组比较，#<0. 05)。试验结果显示，VD模型组大鼠跳台试验潜伏期与正常对照组比较明显缩短，与阳性对照组比较，无显著性差异； VD模型组大鼠避暗试验潜伏期与正常对照组比较明显缩短，与阳性对照组比较，无显著性差异。表明造模比较理想。
图2水胺硫磷诱发VD模型大鼠跳台、避暗试验错误次数结果(_ t s)(与阳性对照组比较，*P<0. 05 ；与正常对照组比较，#<0. 05)。试验结果显示，VD模型组大鼠跳台试验错误次数与正常对照组比较明显增多，与阳性对照组比较，无显著性差异；VD模型组大鼠避暗试验错误次数与正常对照组比较明显增多，与阳性对照组比较，无显著性差异。表明造模比较理想。
图3水胺硫磷诱发VD模型大鼠颈总动脉内皮依赖性舒张反应(endothe 1 ium dependence relaxation reaction，EDRR)女台
图4水胺硫磷诱发VD模型大鼠颈总动脉EDRR检测Γ 士S)。与阳性对照组比较，*Ρ<0. 05 ；与正常对照组比较，#<0. 05。与正常对照组比较，VD模型组EDRR反应明显降低， 血管内皮功能显著下降；与阳性对照组比较，VD模型组EDRR反应无明显差异。表明造模比较理想。
图5水胺硫磷诱发VD模型大鼠颈总动脉血管内膜光镜及电镜观察结果(光镜照片采自新乡医学院组织胚胎学教研室；电镜照片采自新乡医学院电镜室)。光镜下，VD模型组颈总动脉血管内膜出现明显断裂痕迹，内膜皱褶增多，脂质于内皮下沉积，有动脉硬化倾向；血管内膜下平滑肌层细胞排列紊乱，肌层出现明显断裂、融合现象，延续性较差，肌细胞间纤维组织增生；肌层下纤维结缔组织疏松，肌层与结缔组织界限不清楚。电镜下，VD模型组内皮细胞膜出现破裂现象，平滑肌细胞延伸入内皮细胞胞浆；内皮基膜断裂，断裂处有大量胶原纤维组织增生；内皮细胞内高尔基体增多，线粒体肿胀、线粒体嵴融合或缺失。
图6水胺硫磷诱发VD模型大鼠海马CAl区皮层光镜及电镜观察结果(光镜照片采自新乡医学院组织胚胎学教研室；电镜照片采自新乡医学院电镜室)。光镜下，VD模型组海马CAl区三层锥体细胞排列紊乱；部分锥体细胞肿胀，并有炎细胞浸润，星形胶质细胞增生；部分锥体细胞胞体变小或呈三角形，顶树突延长，有核固缩和破裂现象，胞浆呈均勻嗜伊红色；部分锥体细胞胞核变浅，基质疏松伴明显的微空泡形成；血管周围有红细胞渗出， 尚可见小血管增生。电镜下，VD模型血脑屏障内膜不光滑；神经元细胞皱缩、膜结构不清； 胞核固缩，染色质聚集成团、边集，异染色质增多，核周可见高电子密度团块；高尔基体增多，线粒体肿胀，线粒体嵴融合并出现空泡变性。
具体实施方式
实施方式用于说明本发明，但不限制本发明的范围。大鼠体质量为200g，水胺硫磷浓度为20%。按照灌胃浓度为0. 5mg/kg计算，该大鼠需水胺硫磷0. Img0移液管吸取20%的水胺硫磷0. 5ml移至量筒中，即为含0. Img水胺硫磷的溶液。灌胃容量要求为0. 6ml(3ml/ kgX0. ^cg)。因此，在量筒中添加蒸馏水至0. 6ml，灌胃针全部吸取后，对SD大鼠进行灌胃。
实验例检测水胺硫磷灌胃法建立VD模型的可行性。
1、药物水胺硫磷(LS93564，20%，湖北沙隆达股份有限公司)。
2、目的利用水胺硫磷对SD大鼠进行灌胃M周建立VD模型。
3、仪器大鼠跳台记录系统、大鼠避暗仪、Morris水迷宫(淮北正华生物仪器设备有限公司);MD3000生物信号采集系统(淮北正华生物仪器设备有限公司);TS1000尼康显微镜(日本尼康公司)；HT7700日立透射电子显(日本日立公司)。
4、动物6周龄、雄性、18(T220g、清洁级、健康SD大鼠(河南省实验动物中心)。
5、实验分组①正常对照组6周龄、雄性、18(T220g、清洁级、健康SD大鼠10只，5常规饲养M周；②VD模型组6周龄、雄性、18(T220g、清洁级、健康SD大鼠10只，对其进行水胺硫磷灌胃，灌胃浓度为0. 5mg/kg，灌胃容量为3ml/kg，灌胃频率为隔日1次，灌胃周期为对周；③阳性对照组6周龄、雄性、18(T220g、清洁级、健康SD大鼠10只，采用2V0制备大鼠VD模型。术前1 禁食，4h禁水。用10%水合氯醛(0. 33ml/100g)腹腔注射麻醉， 保证手术期间有自主呼吸。仰卧固定，颈部去毛、强力碘消毒后沿颈正中切开，分离出双侧颈总动脉，并套以双重“0”号线，在双侧颈总动脉的近心端及远心端分别结扎，并从中间离断，以确保阻断动脉血流。注意术中无菌操作，手术切口给予庆大霉素注射液2 ml，缝合切口。术后将动物送至通风良好的动物房饲养；④阴性对照组16周龄、雄性、18(T220g、清洁级、健康SD大鼠10只，术前12h禁食，4h禁水。用10%水合氯醛(0.3:3ml/ IOOg)腹腔注射麻醉，保证手术期间有自主呼吸。大鼠麻醉后只分离双侧颈总动脉，但不结扎、不离断动脉。
6、实验内容大鼠跳台试验、大鼠避暗试验、大鼠Morris水迷宫试验、EDRR检测、 大鼠颈总动脉内膜光镜及电镜观察、大鼠大脑海马CAl区皮层光镜及电镜观察。
7、统计学方法所有数据以均数士标准差(―士s)表示。组间差异比较用ANOVA 及Newman-Student多重比较；t检验分析，由SPSS13. 0统计软件完成，双侧P < 0. 05认为差异有显著性。
8、结果8.1水胺硫磷诱发VD模型大鼠跳台试验结果见表1。VD模型组大鼠跳台试验潜伏期与正常对照组比较明显缩短，与阳性对照组比较，无显著性差异；VD模型组大鼠平均5分钟错误次数与正常对照组比较明显增多，与阳性对照组比较，无显著性差异。表明造模比较理想。
表1水胺硫磷诱发VD模型大鼠跳台试验结果G 士 s)
权利要求
1.一种建立血管性痴呆大鼠模型的新型方法。
2.根据权利要求1所述的大鼠，其特征在于清洁级、健康SD大鼠，鼠龄为6周龄，性别为雄性，体质量为18(T220g。
3.根据权利要求1所述的新型方法，其特征在于采用水胺硫磷对SD大鼠进行长期灌田冃°
4.根据权利要求3所述的灌胃，其特征在于灌胃容量为;3ml/kg，灌胃浓度为0.5mg/kg, 灌胃频率为隔日1次。
5.根据权利要求3所述的长期，其特征在于灌胃周期为M周。
全文摘要
本发明公开了一种建立血管性痴呆大鼠模型的新型方法。该方法采用水胺硫磷对6周龄、雄性、180~220g、清洁级、健康Sprague-Dawley(SD)大鼠进行长期灌胃。水胺硫磷的灌胃浓度为0.5mg/kg，灌胃容量为3ml/kg，灌胃频率为隔日1次，灌胃周期为24周。通过水胺硫磷对SD大鼠脑血管及大脑神经组织造成慢性损伤以建立血管性痴呆大鼠模型。
文档编号A01K67/027GK102512259SQ20111036630
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月18日 优先权日2011年11月18日
发明者侯软玲, 尹雅玲, 张洁, 张群妹, 朱利红, 李鹏, 杨帆, 毕凌云, 潘国聘, 王亚莉, 王倩倩, 王建刚, 王永霞, 袁向山, 陈杰, 马丽娟 申请人:新乡医学院