专利名称：一种在同一只大鼠体内建立多种疾病模型的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体涉及一种在同一只大鼠体内建立多种疾病模型的 方法。
背景技术：
冠心病、脑中风、高血脂、高血糖、风湿性关节炎等疾病严重危害着人类健 康，患病人群呈现逐步增多的趋势。采用动物模型进行新化合物的活性筛选是新 药开发中常用的方法，系统全面的评价药物在一种或者多种适应症的生理活性是 药物临床应用的基础。由于新药开发的成本不断增加、时间逐步增长，在一定程 度上制约了新药开发的进程。目前，在新药开发的前期过程中，采用细胞水平的 大规模筛选已应用广泛，但因体内、体外生理环境的差异，使细胞水平的实验结 果并不能有效、准确地说明化合物的适应症。目前文献报道单一的动物模型很多， 例如心肌缺血动物模型、脑缺血动物模型、高血糖动物模型、高血脂动物模型、 风湿性关节炎动物模型等，'但在研究中，由于往往只能采用单一模型进行药物在 体研究，因而，耗时长，动物使用数量多，成本高。另外， 一次实验只能判断化 合物的一种适应症，并且与一般临床疾病患者病症和并发症并存的情况不符。因 此，单一的动物模型不能满足新药开发的需要，因此，建立在一只动物体内多种 疾病的实验动物模型，成为研究的新目标，这样，不但可以有效快捷的筛选化合 物的药效及其机理，发现目标化合物潜在的新的临床适应症，而且能降低成本， 减少动物使用的数量。
本发明要解决的技术问题是在一只动物体内建立多个疾病的动物模型，它和人类疾病及其并发症状况相似，能够有效筛选化合物的药效和作用耙点，耗时短， 动物使用量少，成本低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是在同一只动物体内建立多个疾病的动物模型， 它和人类疾病及其并发症状况相似，能够有效筛选化合物的药效和作用耙点，耗 时短，动物使用量少，成本低。
本发明提供了一种在同一只大鼠体内建立多种疾病动物模型的方法。 本发明提出的在同一只大鼠体内建立多种疾病动物模型的方法通过以下方 案实现
(1) 建立大鼠高血脂模型；
(2) 在(1)中的大鼠上建立高血脂和风湿性关节炎模型；
(3) 在(2)中的大鼠上建立高血脂和风湿性关节炎并高血糖模型；
(4) 在(3)中的大鼠上建立高血脂和风湿性关节炎并高血糖及心肌缺血模
型；
(5) 在(4)中的大鼠上建立高血脂和风湿性关节炎并高血糖及心肌缺血又 脑缺血模型。本发明在在一只大鼠体内建立多种疾病动物模型的方法的具体步骤 如下
(1)建立大鼠高血脂模型
选取无特殊病原体的Wistar大鼠，雄性，160±10g，适应无特殊病原体级 动物实验室环境(温度20-26°C、日温差《3。C、相对湿度40-70%、换气次数 10-15次/小时、气流速度，0. 1-0. 2m/s、压强梯度20Pa、空气洁净度10000 级、落下菌数个《3/皿、氨浓度《14mg/m3、
噪声《60dB、照度150 3001x、昼夜明暗交替时间12/12h) 3天，实验前1天，称体重，禁食不禁水12小时，眼睚后静脉丛取血测定血清中总胆固醇、甘
油三酯和高密度脂蛋白含量；选择血脂合格(总胆固醇在1.5-2.5mmol/L之间、 甘油三酯在1.0-2.0 mmol/L之间)的大鼠分为正常组和模型组，将普通饲料(水 分7. 42%、粗蛋白22. 35%、粗脂肪5. 68%、粗灰分5. 16%、粗纤维7. 24%、钙1. 24%、 磷0.89%、水溶性氯化物0.40%)放入正常组大鼠鼠笼盖上，大鼠自由食用，将 高脂饲料(8%蛋黄粉、1.5%胆固醇、10%猪油、0.1%胆盐)放入模型组大鼠鼠 笼盖上，大鼠自由食用30天，并采用试剂盒测定血中总胆固醇、甘油三酯和高 密度脂蛋白胆固醇的含量，并以模型组和正常组血脂水平比较有统计学上的显著 差异(P<0.05)为造模成功的标准。
(2) 在完成(1)步骤后的大鼠中建立高血脂和风湿性关节炎模型 在完成(1)步骤后的模型组大鼠右足掌皮内注射10mg/ml的Freund's佐
剂，连续观察8天，并测定正常组和模型组大鼠足肿胀的厚度，并以模型组大鼠 足掌厚度和正常组大鼠比较有统计学上的显著差异(P<0.05)为造模成功的标 准。
(3) 在完成(2)步骤后的大鼠中建立高血脂和风湿性关节炎及高血糖模型 在完成(2)步骤后的正常组和模型组大鼠均禁食24小时，于模型组大鼠腹
腔注射50mg/kg链尿菌素，测定大鼠血糖的含量，以模型组大鼠血糖值和正常组 大鼠血糖值比较有统计学上的显著差异(P<0.05)为造模成功的标准。
(4) 在完成(3)步骤后的大鼠建立高血脂和风湿性关节炎及高血糖并心肌 缺血模型
在完成(3)步骤后的大鼠的实验过程中，以10%的乌拉坦腹腔注射麻醉， 气管插管，接人工呼吸机，开胸，于冠状动脉左前降支结扎，测定结扎前及结扎 后10分钟、20分钟、30分钟、60分钟的心电图变化，于结扎2.5小时后取心脏 测定心肌梗死面积。以模型组大鼠T波值和正常组大鼠T波值比较有统计学上的显著差异(P<0.05)和出现心肌梗死为造模成功的标准。
(5)在完成(4)步骤后的大鼠建立高血脂和风湿性关节炎及高血糖并心肌
缺血又脑缺血模型
在完成(4)步骤大鼠的实验后，立即取大鼠右侧颈部切口，分离出颈 总动脉、颈外动
脉和颈内动脉，并沿着颈内动脉向下分离翼腭动脉，将栓线从右侧颈总动脉 切口处缓慢插入约20毫米再向回拉2毫米，固定栓线，缝合伤口，术后24小时， 进行神经行为学评分和取脑测定脑梗死面积。神经行为学评分标准为0分行
为无异常；0.5分竖毛，轻度运动低下；1.0分前肢屈曲，运动障碍；2.0 分行动不协调，屈曲姿势，旋转运动；3.0分偏瘫，不能站立和行走；4.0 分痉挛，昏睡；5.0分死亡。1-3分为造模成功。 本发明的有意效果是
本发明提供的方法与现有的各种大鼠的疾病模型相比，更真实的模拟了临床 疾病的发生及其存在的并发症的实际情况，可针对性的用于筛选冠心病、心绞痛、 高血压、高血脂、高血糖、风湿性关节炎的药物。即通过少量的多疾病模型动物， 筛选出化合物的药效以及其作用耙点，同时还可以通过本发明建立的动物模型发 现化合物新的适应症，比单一的动物模型在研究周期、使用动物数量、成本、发 现化合物潜在适应症等方面有明显优势。
具体实施例方式
本发明结合具体实例作进一步说明。应理解，这些实例仅用于说明之目的， 而不限于本发明范围。
实施例1建立大鼠高血脂和风湿性关节炎模型
实验采用Wistar大鼠，将普通饲料(水分7.42%、粗蛋白22.35%、粗脂肪
85. 68%、粗灰分5. 16%、粗纤维7. 24%、钙1. 24%、磷0. 8996、水溶性氯化物0. 40%)
放入正常组大鼠鼠笼盖上，大鼠自由食用，将高脂饲料(8%蛋黄粉、1.5%胆固
醇、10%猪油、0.1%胆盐)放入模型组大鼠鼠笼盖上，大鼠自由食用，连续给予
30天。分别于给予高脂饲料后30天对大鼠眼眶后静脉丛取血，3000转离心10
分钟，分离血清，测定血清中胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白含量。在给予高
脂词料的第22天，在模型组大鼠右侧足掌皮内注射10毫克/毫升的Freund's佐
剂，并于注射佐剂后的第8天测定大鼠足厚度。 表i大鼠高血脂和风湿性关节炎模型
组别 动物数 检测指标 量
胆固醇甘油三脂 高密度脂蛋白 足厚度
(mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mm)
正常组10 2.06±0.221.10±0.21 1.10±0.22 4.89±0.23
模型组10 3.71 ±0.70** 1.83±0.30** 0.86±0.11**7.61 ±0.29**
~**P<0.01表示模型组与正常组比较有非常显著性差异
表l的结果显示，模型组大鼠血中的胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白与正
常组比较有非常显著性差异(P<0.01)，模型组大鼠足厚度与正常组比较有非常 显著性差异(P<0.01)，表明本发明建立大鼠高血脂和风湿性关节炎模型成功。 实施例2建立大鼠髙血脂和风湿性关节炎并高血糖模型。
在上述实施例l中的大鼠，于实验开展的第30天，模型组继续喂以高脂饲 料。在造高血糖模型前禁食不禁水12小时，于大鼠腹腔注射50mg/kg链尿菌素， 测定大鼠血糖含量。
表2大鼠高血脂和风湿性关节炎并高血糖模型
组别动物检测指标
数量胆固醇甘油三脂高密度脂蛋足厚度血糖值(mmo1/1)
Onmol/L)(mmol/L)白(mmol/L)(mm)造模前 造模后
正常组102.061.101.104.894.06±0.25
±0.22±0.21±0.22±0.23模型组103.711.830.867.616.21 16.01
9_±0.70**±0.30** ±0.11** ±0.29** ±0.36 ±1.26****
"P<0.01表示模型组与正常组比较有非常显著性差异；**P<0.01表示造模后与造模前比较有非常显著
性差异
表2的结果显示，在建立大鼠高血脂和风湿性关节炎模型成功的基础上，模 型组大鼠血糖值与正常组比较有非常显著性差异(P<0.01),表明本发明建立大 鼠高血脂和风湿性关节炎并髙血糖模型成功。 实施例3建立大鼠高血脂和风湿性关节炎并高血糖及心肌缺血模型
在上述实施例2中的大鼠，于造高血糖模型成功后的第二天，以乌拉坦1g/kg 腹腔注射麻醉，仰位固定，胸部、颈部备皮待用，颈部做气管插管，连接呼吸机 及生理记录仪，稳定30分钟后记录正常心电图。15分钟后，进行冠状动脉结扎 手术，术后连接生理记录仪，记录药前、结扎后10分钟、20分钟、30分钟、 60分钟心电图。剪取心脏，采用硝基四氮唑蓝染色法染色，计算梗死面积。
表3大鼠髙血脂和风湿性关节炎并高血糖及心肌缺血模型
组别动物检测指标
数量胆固醇甘油三脂高密度脂蛋足厚度血糖值(mmo1/1)
(mmol/LO(mmol/L)白(mmol/L)(mm)造模前造模后
正常组102.06 ±0.221.10 ±0.211.10 ±0.224.89 ±0.234.06±0.25模型组103.711.830.867.616.2116.01
±0.70**±0.30**±0.11**±0.29**±0.36±1.26****
续表3大鼠髙血脂和风湿性关节炎并高血糖及心肌缺血模型组别动物心脏T波(mV)心肌梗死 TST扣 f O厶、
数量结扎前结扎后囬积 、76 J
10分钟20分钟30分钟60分钟
正常组100.070.080.100.090.09——
±0.03±0.05±0.05±0.04±0.05
模型组100.080.390.430.400.4436.11
±0.04±0.12**** ±0.25**** ±0.19****±0.21 ****±19.26
** P<0. 01表示模型组与正常组比较有非常显著性差异；"P<0. 01表示造模 后与造模前比较有非常显著性差异，结扎后与结扎前比较有非常显著性差异
表3的结果显示，在建立大鼠高血脂和风湿性关节炎并高血糖模型成功的基 础上，模型组大鼠心脏T波值与正常组比较有非常显著性差异(P<0.01)，与自
10身造模前比较有非常显著性差异(P<0.01)，表明本发明建立大鼠高血脂和风湿性关节炎并高血糖及心肌缺血模型成功。
实施例4建立大鼠高血脂和风湿性关节炎并高血糖及心肌缺血又脑缺血模型
在上述实施例3中的大鼠，取大鼠右侧颈部切口，分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，并沿着颈内动脉向下分离翼腭动脉，将栓线从右侧颈总动脉切口处缓慢插入约20毫米，再向回拉2毫米，固定栓线，缝合伤口，并进行神经学评分。实验过程维持大鼠肛温37士0.5'C。模型成功的判断为行为神经检査等级评分0分行为无异常；0.5分竖毛，轻度运动低下；1.0分前肢屈曲，运动障碍；2.0分行动不协调，屈曲姿势，旋转运动；3.0分偏瘫，不能站立和行走；4.0分痉挛，昏睡；5.0分死亡。术后24小时，测定行为学评分后将脑取出，去掉嗅球，小脑和低位脑干，冠状切片，采用氯化三苯基四氮唑染色，计算梗死面积。
表4大鼠髙血脂和风湿性关节炎并髙血糖及心肌缺血又脑缺血模型
组别动物各评分分数大鼠数量(只)
数量00.51.02.03.04.05.0脑梗死面积(％)
分分分分分分分
正常组1010000000—
模型组10000640031.09±13.61
表4的结果显示，在建立大鼠高血脂和风湿性关节炎并高血糖模型及心肌缺血成功的基础上，模型组大鼠神经行为学评分中有6只2,0分，4只3.0分，脑梗死面积达31.09±13.61%明脑缺血模型成功。
以上实验结果表明，本发明建立大鼠高血脂和风湿性关节炎并高血糖及心肌缺血又脑缺血模型成功。
权利要求
1.一种在同一只大鼠体内建立多种疾病动物模型的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)建立大鼠高血脂模型选取无特定病原体级Wistar大鼠，雄性，160±10g，适应无特定病原体级动物实验室环境3天，实验前1天，称体重，禁食不禁水12小时，眼眶后静脉丛取血测定血清中总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白含量；选择血脂中总胆固醇在1.5-2.5mmol/L之间、甘油三酯在1.0-2.0mmol/L之间的大鼠分为正常组和模型组，正常组喂以普通饲料水分7.42％、粗蛋白22.35％、粗脂肪5.68％、粗灰分5.16％、粗纤维7.24％、钙1.24％、磷0.89％、水溶性氯化物0.40％，模型组喂以高脂饲料8％蛋黄粉、1.5％胆固醇、10％猪油、0.1％胆盐30天，并采用试剂盒测定血中总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇的含量，并以模型组和正常组血脂水平比较有统计学上的显著差异为造模成功的标准；(2)在完成(1)步骤后的大鼠中建立高血脂和风湿性关节炎模型在完成(1)步骤后的模型组大鼠右足掌皮内注射10mg/ml的Freund’s佐剂，连续观察8天，并测定正常组和模型组大鼠足肿胀的厚度，并以模型组大鼠足掌厚度和正常组大鼠比较有统计学上的显著差异P＜0.05为造模成功的标准；(3)在完成(2)步骤后的大鼠中建立高血脂和风湿性关节炎及高血糖模型在完成(2)步骤后的正常组和模型组大鼠均禁食24小时，于模型组大鼠腹腔注射50mg/kg链尿菌素，测定大鼠血糖的含量，以模型组大鼠血糖值和正常组大鼠血糖值比较有统计学上的显著差异为造模成功的标准P＜0.05；(4)在完成(3)步骤后的大鼠建立高血脂和风湿性关节炎及高血糖并心肌缺血模型在完成(3)步骤后的大鼠的实验过程中，以10％的乌拉坦腹腔注射麻醉，气管插管，接人工呼吸机，开胸，于冠状动脉左前降支结扎，测定结扎前及结扎后10分钟、20分钟、30分钟、60分钟的心电图变化，于结扎2.5小时后取心脏测定心肌梗死面积；以模型组大鼠T波值和正常组大鼠T波值比较有统计学上的显著差异P＜0.05和出现心肌梗死为造模成功的标准；(5)在完成(4)步骤后的大鼠建立高血脂和风湿性关节炎及高血糖并心肌缺血又脑缺血模型在完成(4)步骤大鼠的实验后，立即取大鼠右侧颈部切口，分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，并沿着颈内动脉向下分离翼腭动脉，将栓线从右侧颈总动脉切口处缓慢插入约20毫米再向回拉2毫米，固定栓线，缝合伤口，术后24小时，进行神经行为学评分和取脑测定脑梗死面积；神经行为学评分标准为0分行为无异常；0.5分竖毛，轻度运动低下；1.0分前肢屈曲，运动障碍；2.0分行动不协调，屈曲姿势，旋转运动；3.0分偏瘫，不能站立和行走；4.0分痉挛，昏睡；5.0分死亡；1-3分为造模成功。
2. 根据权利要求1所述的一种在同一只大鼠体内建立多种疾病动物模型的方法，其特征在于在同一只大鼠体内同时建立高血脂和风湿性关节炎并高血糖及心肌缺血又脑缺血模型。
3. 根据权利要求1所述的一种在同一只大鼠体内建立多种疾病动物模型的方法，其特征在于在同一只大鼠体内同时建立高血脂和风湿性关节炎并高血糖及心肌缺血模型。
4. 根据权利要求1所述的一种在同一只大鼠体内建立多种疾病动物模型的方法，其特征在于在同一只大鼠体内同时建立高血脂和风湿性关节炎并高血糖模型。
5. 根据权利要求1所述的一种在同一只大鼠体内建立多种疾病动物模型的方法，其特征在于在同一只大鼠体内同时建立高血脂和风湿性关节炎模型。
6.根据权利要求1所述的一种在同一只大鼠体内建立多种疾病动物模型的 方法，其特征在于通过该方法在同一只大鼠体内建立的多种疾病动物模型用于 筛选治疗心肌缺血药物、治疗脑缺血药物、治疗高脂血症药物、治疗高血糖药物 或治疗风湿关节炎药物的一种适应症或一种以上适应症治疗药物。
全文摘要
本发明提供一种在同一只大鼠体内建立多种疾病模型的方法。通过本发明的方法，在同一只大鼠体内同时建立了心肌缺血、脑缺血、高血脂、高血糖、风湿性关节炎等病症的模型，经过检测相关特异性指标确证了多种疾病模型已建立。本发明更真实的反映了临床人体病症及并发症存在的实际情况，为药物筛选提供了更高效的方法，缩短了研发周期，减少了动物使用数量，降低了成本，有较大的应用价值。
文档编号A61P3/00GK101513533SQ20081003371
公开日2009年8月26日 申请日期2008年2月20日 优先权日2008年2月20日
发明者宋浩亮, 张劲涛, 晨 毛, 陈春麟 申请人:上海美迪西生物医药有限公司;美迪西普亚医药技术(上海)有限公司