专利名称：快速获得花生不亲和野生种与栽培种种间杂种的方法
技术领域：
本发明涉及植物远缘杂交技术，具体涉及一种通过授粉后药物诱导快速、大量获得花生不亲和野生种与栽培种种间杂种的方法。
背景技术：
花生是世界五种最重要的油料作物之一。品种间杂交迄今仍是花生育种的主要方法，但因花生栽培种遗传基础狭窄，要通过这一方法育成突破性的品种已越来越难。越来越多的花生育种工作者认识到，花生野生种尤其是花生区组以外的不亲和野生种遗传多样性程度显著高于栽培种，富含抗性、优质和高产遗传因子，应该在花生育种中加以利用。花生区组野生种容易与栽培种杂交获得有生活力的杂种。花生区组以外的野生种则与栽培种杂交不亲和，受精延迟、受精率低，虽然多数情况下可产生果针并形成荚果，但胚在早期败育，最终只能形成有败育种子遗迹的空果，要利用这些野生种必须借助特殊的技术手段。授粉后激素涂抹进而进行胚和胚珠培养是国际半干旱热带作物研究所采用的行之有效的获得花生区组间杂种的方法。山东省花生研究所分子育种组通过果针离体培养技术成功获得了栽培种与光叶野生种Arachisglabrata的种间杂种,并在国内外育成第一个花生区组间杂交品种-花育31号。但上述方法均需要冗长繁琐的组织培养步骤，育种上迫切需要简便易行获得花生不亲和杂种的方法。
发明内容
本发明的技术效果能够弥补现行的获得花生不亲和野生种与栽培种种间杂种方法中需要繁琐复杂组织培养步骤的缺点，提供一种快速获得花生不亲和野生种与栽培种种间杂种的方法，其在田间就可操作且能够高效获得大量种间杂种。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案其包括如下步骤(I)配制激素混合溶液；(2)收集不亲和花生野生种花粉，授与花生栽培种母本；(3)蘸取激素混合液，敷于已授粉栽培种母本花基部；(4)对收获种子进行分子鉴定。本发明的内容是在花生植株开花时期，不亲和野生种花粉授与栽培种母本后，使用一种激素混合溶液处理花器官，使荚果和种子能够正常发育，从而收获种间杂种种子。步骤(I)中激素混合溶液的配比为吲哚乙酸0.2-5mg/L、赤霉素0.5-6mg/L、 6-苄基氨基嘌呤0_4mg/L，其余为无菌去离子水。步骤(3)中用脱脂棉蘸取激素混合液，敷于已授粉栽培种母本花基部。步骤(4)中分子鉴定包括如下步骤(A)收获种子后，取花生子叶组织薄片，快速提取待测样品DNA作为PCR模板；(B)用分子标记方法对提取的模板进行鉴定，若与父本有相同的特征带，则为真杂种，否则就是假杂种。本发明的提供一种快速获得花生不亲和野生种与栽培种种间杂种的方法，其在田间就可操作且能够高效获得大量种间杂种，省去了冗长繁琐的组织培养步骤，可简便易行获得花生不亲和杂种。
图I为栽培种大花生QYlOl X不亲和野生种A. paraguariensis PI 331187杂交组合从母木本上收获的种子，上排和中排为真杂种，下排为假杂种；图2利用FAD2A AS-PCR法对区组间杂种进行真实性鉴定部分结果示意图。图中M DNA marker ;AP、QY :父本 QYlOl 和母本 A. paraguariensis PI331187 ；T 真杂种；F :假杂种；箭头所指为父本特征带。
具体实施例方式实施例I本发明的方法包括如下步骤(I)配制含卩引哚乙酸2mg/L、赤霉素2mg/L、6_节基氨基嘌呤2mg/L、其余为无菌去离子水的激素混合液。(2)收集不亲和花生野生种花粉，授与花生栽培种母本，授粉过程同常规。(3)用脱脂棉蘸取激素混合溶液，敷于已授粉栽培种母本花基部。(4)收获种子后，取花生子叶组织薄片，采用“花生健康组织和病组织简便快速 DNA提取方法”(专利号=200910255786. O)快速提取待测样品DNA作为PCR模板。(5)采用“花生Λ12-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法”(专利申请号 201110058563. 2，已公开)或其他分子标记鉴定方法对提取的模板进行鉴定，如与父本有相同的特征带，则为真杂种，否则就是假杂种。我们用本技术的方法做了多个不亲和野生种与栽培种的杂交组合，经分子鉴定均已收获到真实杂种。以栽培种大花生QYlOl XA. paraguariensis PI331187杂交组合为例，从母本上收获的“杂交”种子连同双亲种子或叶片，采用“花生健康组织和病组织简便快速DNA提取方法”(专利号=200910255786. O)所述方法非破坏性地快速提取花生种子 DNA或提取叶片DNA。采用“花生△ 12-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法”(专利申请号 201110058563. 2，已公开)中所述对FAD2A准确进行基因分型的AS-PCR方法，证实了母本 QYlOl与父本A. paraguariensis PI 331187FAD2A基因分别为突变型和野生型。以此为鉴定依据，如“杂交”种子模板扩增得到与父本相同的特征带就是真杂种，否则是假杂种。共检测了 42粒从母本上收获的套有果针的种子(如图I)，从中鉴定出26粒真杂种(图I上排和中排为真杂种，下排为假杂种)。图2为分子鉴定的部分结果。实施例2本发明的方法包括如下步骤(I)配制含吲哚乙酸4mg/L、赤霉素2mg/L、其余为无菌去离子水的激素混合液。(2)收集不亲和花生野生种花粉，授与花生栽培种母本，授粉过程同常规。(3)用脱脂棉蘸取激素混合溶液，敷于已授粉栽培种母本花基部。
(4)收获种子后，取花生子叶组织薄片，采用“花生健康组织和病组织简便快速 DNA提取方法”(专利号=200910255786. O)快速提取待测样品DNA作为PCR模板。(5)采用“花生Λ12-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法”(专利申请号 201110058563. 2，已公开)或其他分子标记鉴定方法对提取的模板进行鉴定，如与父本有相同的特征带，则为真杂种，否则就是假杂种。我们用本技术的方法做了多个不亲和野生种与栽培种的杂交组合，经分子鉴定均已收获到真实杂种。以栽培种大花生QYlOl XA. paraguariensis PI331187杂交组合为例，从母本上收获的“杂交”种子连同双亲种子或叶片，采用“花生健康组织和病组织简便快速DNA提取方法”(专利号=200910255786. O)所述方法非破坏性地快速提取花生种子 DNA或提取叶片DNA。采用“花生△ 12-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法”(专利申请号 201110058563. 2，已公开)中所述对FAD2A准确进行基因分型的AS-PCR方法，证实了母本 QYlOl与父本A. paraguariensis PI 331187 FAD2A基因分别为突变型和野生型。以此为鉴定依据，如“杂交”种子模板扩增得到与父本相同的特征带就是真杂种，否则是假杂种。共检测了 42粒从母本上收获的套有果针的种子(如图I)，从中鉴定出26粒真杂种(图I上排和中排为真杂种，下排为假杂种)。图2为分子鉴定的部分结果。
权利要求
1.一种快速获得花生不亲和野生种与栽培种种间杂种的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)配制激素混合溶液；(2)收集不亲和花生野生种花粉，授与花生栽培种母本；(3)蘸取激素混合液，敷于已授粉栽培种母本花基部；(4)对收获种子进行分子鉴定。
2.根据权利要求I所述的快速获得花生不亲和野生种与栽培种种间杂种的方法，其特征在于，步骤⑴中激素混合溶液的配比为卩引哚乙酸O. 2-5mg/L、赤霉素O. 5-6mg/L、6-苄基氨基嘌呤0-4mg/L,其余为无菌去离子水。
3.根据权利要求I或2所述的快速获得花生不亲和野生种与栽培种种间杂种的方法， 其特征在于，步骤(3)中用脱脂棉蘸取激素混合液，敷于已授粉栽培种母本花基部。
4.根据权利要求3所述的快速获得花生不亲和野生种与栽培种种间杂种的方法，其特征在于，步骤(4)中分子鉴定包括如下步骤(A)收获种子后，取花生子叶组织薄片，快速提取待测样品DNA作为PCR模板；(B)用分子标记方法对提取的模板进行鉴定，若与父本有相同的特征带，则为真杂种， 否则就是假杂种。
全文摘要
本发明涉及植物远缘杂交技术，具体涉及一种通过授粉后药物诱导快速、大量获得花生不亲和野生种与栽培种种间杂种的方法。本发明的快速获得花生不亲和野生种与栽培种种间杂种的方法，包括如下步骤(1)配制激素混合溶液；(2)收集不亲和花生野生种花粉，授与花生栽培种母本；(3)蘸取激素混合液，敷于已授粉栽培种母本花基部；(4)对收获种子进行分子鉴定。其在田间就可操作且能够高效获得大量种间杂种，省去了冗长繁琐的组织培养步骤，可简便易行获得花生不亲和杂种。
文档编号A01H1/02GK102577930SQ201210058618
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者于洪涛, 凤桐, 吴琪, 唐月异, 唐荣华, 崔凤高, 王传堂, 王秀贞, 禹山林, 胡东青, 陈殿绪, 高华援 申请人:山东省花生研究所