专利名称：一种家畜精液冷冻稀释液及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物生殖生理与繁殖技术领域，具体涉及一种家畜精液冷冻稀释液及其制备方法和应用。
背景技术：
尽管家畜精液冷冻保存研究已经开展了 50多年，但是解冻后的精液活力仅在30%-50%左右，人工授精后不返情率和产仔率均显著低于新鲜和低温冷藏精液。家畜精液冷·冻过程中，细胞内外形成的冰晶对动物精子造成的机械损伤直接导致冷冻后精子活力的下降，如何降低冰晶的产生、减少冰晶对家畜精子的损伤一直是家畜繁殖技术和低温生物学研究领域的研究热点。通过改变精液稀释液的组成成分可以降低冷冻处理对精子的损伤，目前，渗透性有机溶剂和糖类已经应用于哺乳动物精液的冷冻保存研究中，但是有机溶剂和糖类并不能解决细胞内外冰晶的产生问题。1969年，DeVries和Wohlschlag发现了一种新型的冰晶抑制剂-抗冻蛋白。抗
冻蛋白通过修饰冰晶性状和抑制重结晶等作用方式来减少冰晶对组织细胞的机械损伤。一些研究表明，抗冻蛋白能提高人类和一些哺乳动物精液冷冻保存后的顶体完整性和活力。然而，抗冻蛋白的应用也存在一定的局限性。首先，作为一种异源蛋白，抗冻蛋白可能导致动物产生一定的免疫反应；其次，目前抗冻蛋白的主要来源是从极地海洋鱼类的血液中提取，而且这些技术和专利主要掌握在欧美国家手中，价格高昂；最后，抗冻蛋白的纯度也存在一定的问题，这可能是导致相关研究结果之间差异甚至矛盾的主要原因。
发明内容
为解决上述问题，本发明首次采用化学来源的冰晶抑制剂——肌醇类化合物来代替抗冻蛋白应用于哺乳动物精液的冷冻保存，从而避免了与抗冻蛋白应用有关的缺陷，相关的研究未见文献报道。本发明的家畜精液冷冻稀释液的制备方法，包括以下步骤在适量的超纯水中加入三羟甲基氨基甲烷2. 71g、柠檬酸1. 4g、单糖1. 0g、青霉素10万IU，链霉素10万IU，肌醇类化合物O. 29-6. 97g，任选地加入渗透性保护剂5-20ml，搅拌均匀，调整pH值至6. 8-7. 2，加入经灭活处理的新鲜蛋黄5-20ml,混合均勻后定容至100ml,于4°C下15000转/分的速率离心I小时，取上清液用O. 45 ymMillipore滤器过滤即制得。本发明所述肌醇类化合物为1，3-环己二醇、1，4-环己二醇和1，3，5-环己三醇其中之一。本发明所述单糖为葡萄糖或果糖。本发明所述渗透性保护剂为甘油或乙二醇。本发明所述冷冻稀释液分为含渗透性保护剂和不含渗透性保护剂两类。本发明所述的制备方法，其中新鲜蛋黄经56°C、30min的灭活处理。本发明所述制备方法中，优选地采用Tris溶液调整pH值。
本发明所述家畜精液冷冻稀释液在应用上可分为一步法和两步法冷冻。一步法冷冻保存方法，其步骤是，将家畜精液和本发明所述的含有渗透性保护剂的冷冻稀释液按照1:4的比例混合均匀，而后分装于O. 25ml塑料细管内，先缓慢降温至5°C，而后迅速移入液氮气相中熏蒸5min，最后将细管投入液氮冷冻保存。两步法冷冻保存方法，其步骤是，将家畜精液和本发明所述的不含渗透性保护剂的冷冻稀释液按照1:4的比例混合均匀，而后分装于2ml冻存管内，缓慢降温至5°C，而后将冻存管中的溶液和本发明所述的含有渗透性保护剂的冷冻稀释液按照1:1的比例混合均匀，用移液器吸取O. 2ml滴于干冰预冻，最后将冷冻颗粒投入液氮冷冻保存。本发明的技术方案中，所述三羟甲基氨基甲烷为缓冲物质，柠檬酸为溶质，可能也参与糖酵解作用，所述果糖或葡萄糖为精子代谢底物，所述蛋黄为低温休克质膜保护剂，所述甘油或乙二醇为渗透性保护剂，所述青霉素和链霉素为抗生素，所述肌醇类化合物为冰晶抑制剂。 本发明的有益效果为本发明针对目前家畜精液冷冻保存研究中存在的主要问题，首次将肌醇类化合物作为冰晶抑制剂代替天然的抗冻蛋白应用于家畜精液的冷冻保存研究中。肌醇类化合物能有效降低精液冷冻过程中冰晶的形成量，减少冰晶对精子的机械性损伤，最终提高哺乳动物冷冻精液的活率、活力、顶体完整性和质膜完整性等技术指标。大量实验表明，通过应用本发明的家畜精液冷冻稀释液进行冷冻保存的家畜精液，解冻后精子的活率在75%左右，活力在50%以上，顶体完整性在60%左右，质膜完整性在50%左右，人工授精后不返情率达到70%以上。本发明中使用的肌醇类化合物是一类常见的化学原料，来源方便、成本低廉、化学性质稳定，使用肌醇类化合物作为精液冷冻稀释液的冰晶抑制齐U，具有不会产生免疫反应、纯度有保证、价格低廉等优点。
具体实施例方式以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，但是本发明的技术方案不以实施例为限。实施例1 :采用电刺激法采集云南半细毛羊精液，而后进行精液品质检测。用于冷冻保存的绵羊精液指标必须满足活力大于70%，精子密度高于3 X 109/ml，精液量为O. 75-2ml。配制精液冷冻稀释液，其步骤为，分别称取三羟甲基氨基甲烷2. 71g、柠檬酸1. 4g、葡萄糖1. 0g、甘油5ml、青霉素10万IU、链霉素10万IU、1,3_环己二醇1. 16g,溶于超纯水，搅拌均匀，采用Tris溶液调整pH值至6. 8-7. 2，使用前加入56°C 30min灭活处理的新鲜蛋黄10ml，混合均匀后定容至100ml，于4°C下15000转/分的速率离心I小时，取上清液用O. 45 μ mMi 11 ipore滤器过滤备用。将符合冷冻要求的绵羊精液和冷冻稀释液按照1:4的比例混合均匀，而后分装于
O.25ml塑料细管内，先缓慢降温至5°C，而后迅速移入液氮气相中熏蒸5min，最后投入液氮冷冻保存。该方法冷冻保存的家畜精液，解冻后精子的活率在75%左右，活力在50%以上，顶体完整性在60%左右，质膜完整性在50%左右，人工授精后不返情率达到70%以上。实施例2
昆明易兴恒畜牧科技有限责任公司养殖基地内采用假阴道采集云岭黑山羊精液，而后进行精液品质检测。用于冷冻保存的绵羊精液指标必须满足活力大于70%，精子密度高于3 X IOVml，精液量为O. 75-2ml。配制精液冷冻稀释液，其步骤为，分别称取三羟甲基氨基甲烷2. 71g、柠檬酸1. 4g、果糖1. Og、甘油5ml、青霉素10万IU、链霉素10万IU、1,4_环己二醇O. 697g,溶于超纯水，搅拌均匀，采用Tris溶液调整pH值至6. 8-7. 2，使用前加入56°C 30min灭活处理的新鲜蛋黄20ml，混合均匀后定容至100ml，于4°C下15000转/分的速率离心I小时，取上清液用O. 45 μ mMi 11 ipore滤器过滤备用。将符合冷冻要求的绵羊精液和冷冻稀释液按照1:4的比例混合均匀，而后分装于 0.25ml塑料细管内，先缓慢降温至5°C，而后迅速移入液氮气相中熏蒸5min，最后投入液氮冷冻保存。该方法冷冻保存的家畜精液，解冻后精子的活率在75%左右，活力在50%以上，顶体完整性在60%左右，质膜完整性在50%左右，人工授精后不返情率达到70%以上。实施例3 昆明易兴恒畜牧科技有限责任公司养殖基地内采用电刺激法采集无角陶赛特公羊精液，而后马上进行精液品质检测。用于冷冻保存的绵羊精液指标必须满足活力大于70%，精子密度高于3 X 109/ml，精液量为O. 75-2ml。配制不含渗透性保护剂的冷冻稀释液，其制备方法为，分别称取三羟甲基氨基甲烷2. 71g、柠檬酸1.4g、葡萄糖l.Og、青霉素10万IU、链霉素10万IU、1，3，5-环己六醇
1.25g，溶于超纯水，搅拌均匀，采用Tris溶液调整pH值至6. 8-7. 2，使用前加入56°C 30min灭活处理的新鲜蛋黄15ml，混合均匀后定容至100ml，于4°C下15000转/分的速率离心I小时，取上清液用O. 45 μ mMi 11 ipore滤器过滤备用。配置含渗透性保护剂的冷冻稀释液，其步骤为，分别称取三羟甲基氨基甲烷2.71g、柠檬酸1.4g、果糖l.Og、乙二醇10ml、青霉素10万IU、链霉素10万IU、1，3_环己二醇1. 16g，溶于超纯水，搅拌均匀，采用Tris溶液调整pH值至6. 8-7. 2，使用前加入56°C 30min灭活处理的新鲜蛋黄15ml,混合均勻后定容至100ml,于4°C下15000转/分的速率离心I小时，取上清液用0. 45 μ mMi 11 ipore滤器过滤备用。将符合冷冻要求的精液和不含渗透性保护剂的冷冻稀释液按照1:4的比例混合均匀，而后分装于2ml冻存管内，先缓慢降温至5°C，而后将上述悬浮液和含渗透性保护剂的冷冻稀释液按照1:1的比例混合均匀，用移液器吸取0. 2ml滴于干冰预冻，最后将冷冻颗粒投入液氮冷冻保存。该方法冷冻保存的家畜精液，解冻后精子的活率在70%左右，活力在60%左右，顶体完整性在70%左右，质膜完整性在60%左右。上述实施例仅用于说明本发明，对本发明的保护范围不构成任何限制。以上对本发明所提供的精液冷冻稀释液配方以及冷冻程序进行了详细介绍。本文通过具体实施方式
对本发明的原理和实施方式进行了阐述，以上说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
权利要求
1.一种家畜精液冷冻稀释液的制备方法，包括以下步骤在适量的超纯水中加入三羟甲基氨基甲烷2. 71g、柠檬酸1. 4g、单糖1. Og、青霉素10万IU，链霉素10万IU，肌醇类化合物0. 29-6. 97g，任选地加入渗透性保护剂5-20ml，搅拌均匀，调整pH值至6. 8-7. 2，加入经灭活处理的新鲜蛋黄5-20ml，混合均匀后定容至100ml，于4°C下15000转/分的速率离心I小时，取上清液用0. 45 V- mMiIIipore滤器过滤即制得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述肌醇类化合物为1，3_环己二醇、1，4_环己二醇和I, 3，5-环己三醇其中之一。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述单糖为葡萄糖或果糖。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述渗透性保护剂为甘油或乙二醇。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中新鲜蛋黄经56°C、30min的灭活处理。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的含有渗透性保护剂的冷冻稀释液。
7.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的不含渗透性保护剂的冷冻稀释液
8.一种家畜精液冷冻保存方法，其步骤是，将家畜精液和权利要求6所述的含有渗透性保护剂的冷冻稀释液按照1:4的比例混合均匀，而后分装于0. 25ml塑料细管内，先缓慢降温至5°C，而后迅速移入液氮气相中熏蒸5min，最后将细管投入液氮冷冻保存。
9.一种家畜精液冷冻保存方法，其步骤是，将家畜精液和权利要求7所述的不含渗透性保护剂的冷冻稀释液按照1:4的比例混合均匀，而后分装于2ml冻存管内，缓慢降温至5°C，而后将冻存管中的溶液和权利要求7所述的含有渗透性保护剂的冷冻稀释液按照1:1的比例混合均匀，用移液器吸取0. 2ml滴于干冰预冻，最后将冷冻颗粒投入液氮冷冻保存。
10.权利要求5或6所述的冷冻稀释液在家畜精液冷冻保存中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种家畜精液冷冻稀释液及其制备方法和应用，在适量的超纯水中加入三羟甲基氨基甲烷2.71g、柠檬酸1.4g、单糖1.0g、青霉素10万IU,链霉素10万IU，肌醇类化合物0.29-6.97g，任选地加入渗透性保护剂5-20ml，搅拌均匀，调整pH值至6.8-7.2，加入经灭活处理的新鲜蛋黄5-20ml，混合均匀后定容至100ml，低温离心1小时，取上清液过滤即制得。由于肌醇类化合物能有效抑制冰晶的产生，降低了冰晶对精子的机械性损伤，解冻后精子的活率在75%左右，活力在50%以上，顶体完整性在60%左右，质膜完整性在50%左右，人工授精后不返情率达到70%以上。使用肌醇类化合物作为精液冷冻稀释液的冰晶抑制剂，具有不会产生免疫反应、纯度有保证、价格低廉等优点。
文档编号A01N1/02GK103004750SQ201210491289
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者洪琼花, 权国波, 杨红远, 李东江, 吕春荣 申请人:云南省畜牧兽医科学院, 昆明易兴恒畜牧科技有限责任公司