家畜精液冷冻保存用抗冻剂、稀释液及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种家畜精液冷冻保存用抗冻剂、稀释液及其应用。所涉及的家畜精液冷冻保存用抗冻剂为甜菜碱。所涉及的家畜精液冷冻保存稀释液包括常规稀释液和抗冻剂，所述抗冻剂为甜菜碱，优选的常规稀释液的配方为：葡萄糖1.1g、柠檬酸1.48g、Tris2.42g、新鲜鸡蛋黄10％、青霉素钠0.06g、硫酸链霉素0.1g、蒸馏水100ml。本发明的家畜精液冷冻保存稀释液尤其适用于牛、猪、羊细管冷冻精液人工授精及精液超低温冷冻后的长期保存和长途运输后输精，可显著提高冷冻-解冻后精子活率、顶体完整率和质膜完整率，保持精子的受精活力。
【专利说明】家畜精液冷冻保存用抗冻剂、稀释液及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于哺乳动物精液的超低温冷冻保存【技术领域】，具体涉及一种家畜精液冷冻保存用抗冻剂，同时还涉及一种家畜精液冷冻保存稀释液，进一步还涉及家畜精液冷冻保存稀释液的应用。
【背景技术】
[0002]哺乳动物精液冷冻保存技术为高度集约化的现代畜牧业发展提供了重要的技术支持。当甘油作为一种冷冻保护剂被用于精液冷冻保存以来，世界各国就开始了大规模的研究与应用。精液冷冻保存时间可以长达数十年之久，解决了哺乳动物雄性种质资源保护问题，使雄性优良种质资源的使用不受时间、地域的限制，便于开展省际、国际之间的协作，提高优良种畜的利用率；在建立全球优良物种基因库，延长优良种畜的使用寿命；在及早进行后裔测定，缩短世代间隔和加快动物育种进程方面以及在保留和恢复精液供应、血统更新、引种、降低生产成本等方面均有重要意义。
[0003]精液冷冻是保存遗传资源，建立精子基因库的重要措施。而冷冻精子质量好坏与家畜的妊娠率、分娩率等密切相关。从目前的情况来看，尽管冷冻精液已经应用于养牛生产，但需要进一步提高精子活率和受精能力；而猪精子在冷冻解冻以后的精子活率、顶体完整率、质膜完整率等要远低于新鲜精液，精子DNA、线粒体等的损伤要高于新鲜精液，导致在商品化养猪生产中，利用冷冻精液进行人工授精时母猪的受胎率和产仔率都较低而不能广泛应用。为了解决这一问题，科研工作者进行了大量的研究，但是冷冻-解冻后精子活率仍不十分理想。
[0004]尽管甘油可以作为一种较好的冷冻保护剂已经可以用于养牛生产，但是以此为基础的冷冻稀释液对精子的保护性能较差，冷冻解冻后精子活率较低，与生产需求还存在较大差距，需要寻找新的冷冻保护剂；而以甘油为基础的冷冻保护剂还不能用于养猪生产。随着全国性、区域性种牛、猪联合育种工作的深入开展，对精液冷冻保护剂研究越来越显得迫切。
[0005]有关甜菜碱作为冷冻保护剂用于牛、猪等家畜精液冷冻保存的研究国内外尚未见相关报道。
【发明内容】
[0006]针对目前家畜精液冷冻的不足之处，本发明目的之一在于提供一种用于家畜精液冷冻保存的抗冻剂。实现该目的的技术方案是:
[0007]—种家畜精液冷冻保存用抗冻剂，所述抗冻剂为甜菜碱。
[0008]所述甜菜碱为从海带中提取的甜菜碱。
[0009]针对现有技术的缺陷或不足，本发明的另一目的在于提供一种抗冻稀释液及其制备方法，能有效提高牛、猪精液冷冻-解冻后的精子活率、顶体完整率、质膜完整率和DNA完整性。实现该目的的技术方案是:
[0010]一种家畜精液冷冻保存稀释液，所述家畜精液冷冻保存稀释液包括常规稀释液和抗冻剂，所述抗冻剂为甜菜碱。
[0011]所述常规稀释液的配方为:葡萄糖1.lg、柠檬酸1.48g、Tris2.42g、新鲜鸡蛋黄10%、青霉素纳0.06g、硫酸链霉素0.lg、蒸懼水100ml。
[0012]所述抗冻剂在每10ml常规稀释液中的添加量为50?250mg。
[0013]所述家畜精液冷冻保存稀释液中添加有体积比为2% -4%的甘油。
[0014]所述家畜精液冷冻保存稀释液的pH值为6.5?7.5。
[0015]上述的家畜精液冷冻保存稀释液用于保存猪精液时，所述抗冻剂在每10ml常规稀释液中的添加量为100?200mg。
[0016]上述的家畜精液冷冻保存稀释液用于保存牛精液时，所述抗冻剂在每10ml常规稀释液中的添加量为150?250mg。
[0017]上述的家畜精液冷冻保存稀释液用于保存羊精液时，所述抗冻剂在每10ml常规稀释液中的添加量为50?lOOmg。
[0018]本发明首次将从海带中提取的甜菜碱作为冷冻抗冻剂用于牛、猪、羊精液冷冻保存，制备方法简单，取材容易，效果可靠，易于推广，适用于牛、猪、羊细管冷冻精液人工授精及精液超低温冷冻后的长期保存和长途运输后输精，可显著提高冷冻-解冻后精子活率、顶体完整率和质膜完整率，保持精子的受精活力。
【具体实施方式】
[0019]本发明的家畜精液冷冻保存常规稀释液的方法，包括下列步骤:
[0020](I)在常规稀释液中加入抗冻剂混匀，所述抗冻剂为甜菜碱；
[0021](2)调节溶液pH值为6.5?7.5，过滤灭菌得家畜精液冷冻保存稀释液。
[0022]如添加有甘油时，在步骤I所配制的稀释液中添加合适量的甘油。优选的，步骤
(I)中在常规稀释液中加入100?200mg抗冻剂时，添加3%的甘油，适合用于猪精液的冷冻保存；在常规稀释液中加入150?250mg抗冻剂时，添加4%的甘油，适合用于牛精液的冷冻保存；常规稀释液中加入50?10mg抗冻剂时，添加2%的甘油，适合用于羊精液的冷冻保存。
[0023]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0024]实施例1:
[0025]准确量取常规稀释液组分(葡萄糖1.lg、柠檬酸1.48g、Tris2.42g、新鲜鸡蛋黄10% (体积)、青霉素钠0.06g、硫酸链霉素0.1g)溶于10ml蒸馏水，添加甜菜碱100?200mg，甘油3%配制成猪用精液冷冻保存稀释液。调节溶液pH值为6.5?7.5，过滤灭菌，冷却至室温，放入4°C冰箱中备用。
[0026]发明人对该实施例的家畜精液冷冻保存稀释液使用效果进行了如下试验。
[0027](一 )精液采集
[0028]用手握法采精，选择中段浓厚部分精液，经4层消毒纱布过滤除去胶状物，用显微镜在37°C下进行常规品质检查。选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在0.7以上的精液用于试验。
[0029]( 二)精液处理与冷冻
[0030]将新鲜精液加入等温的常规稀释液(30°C，1:1稀释)，经纱布包裹后，在15°C恒温箱中平衡lh。将平衡处理过的精液加入4°C的冷冻稀释液，用纱布包裹后置于4°C冰箱中平衡lh。调整精子密度为1.0X 109个/ml，用专用注射器将精液吸入0.25ml细管内，快速封管，置于程序冷冻仪中以1°C /min的速率从4°C缓慢降至-5°C，迅速移至液氮上方2-3cm熏蒸5-10min，将细管投入液氮中保存。
[0031](三)细管冻精的解冻和精子质量评定
[0032]1、精子活率
[0033]将细管冻精取出后迅速放入37°C的水浴中解冻45s，收集于小试管内，然后用常温稀释液稀释，孵育5min，取10 μ L精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400 X倒置显微镜下评价精子活率(直线运动精子百分率)。每次至少检查200个精子，重复5次。
[0034]2、精子顶体完整率
[0035]利用FITC-PNA染液染色后，荧光显微镜观察精子顶体形态。冻精细管解冻后，将精液加到2ml3% PVP液面上，800 X g，3min离心洗2次，弃上清；用PBS (37°C )重悬调整密度至I~2X 106个精子/ml ;吸取30 μ I精子悬液，涂片，空气干燥，用纯甲醇固定1min ；再加入30 μ I FITC-PNA染液，37°C黑暗潮湿环境孵育30min ;PBS冲洗，空气干燥，滴少量甘油:PBS(9:1)，盖片，用无色指甲油封片，尽快在400X荧光显微镜下观察。每次至少检查200个精子，重复5次。
[0036]3、精子质膜完整率
[0037]采用果糖-柠檬酸钠低渗液进行低渗肿胀检测(HOST)。将解冻的精液用常规稀释液稀释，调整精子密度为I X 106个/ml，37°C孵育30 min，取20 μ I精液于悬液滴于血细胞计数板上，400 X显微镜下观察，计算弯尾精子百分率，每次至少检查200个精子，重复5次。
[0038](四)精子质量评定结果
[0039]应用本发明的猪精液冷冻保存抗冻剂以及精液冷冻-解冻方法，评定结果如下:
[0040]当甜菜碱添加量为80~120mg，冷冻-解冻后精子活率达65%，顶体完整率达69%，质膜完整率达72%。
[0041]试验例结果如下表1所示:
[0042]表1
【权利要求】
1.一种家畜精液冷冻保存用抗冻剂，其特征在于，所述抗冻剂为甜菜碱。
2.如权利要求1所述的家畜精液冷冻保存用抗冻剂，其特征在于，所述甜菜碱为从海带中提取的甜菜碱。
3.一种家畜精液冷冻保存稀释液，该家畜精液冷冻保存稀释液包括常规稀释液和抗冻齐IJ，其特征在于，所述抗冻剂为甜菜碱。
4.如权利要求3所述的家畜精液冷冻保存稀释液，其特征在于，所述常规稀释液的配方为:葡萄糖1.lg、柠檬酸1.48g、Tris2.42g、新鲜鸡蛋黄10%、青霉素钠0.06g、硫酸链霉素0.lg、蒸懼水10mlo
5.如权利要求4所述的家畜精液冷冻保存稀释液，其特征在于，所述抗冻剂在每10ml常规稀释液中的添加量为50?250mg。
6.如权利要求5所述的家畜精液冷冻保存稀释液，其特征在于，所述家畜精液冷冻保存稀释液中添加有体积比为2% -4%的甘油。
7.如权利要求3所述的家畜精液冷冻保存稀释液，其特征在于，所述家畜精液冷冻保存稀释液的PH值为6.5?7.5。
8.权利要求3所述的家畜精液冷冻保存稀释液用于保存猪精液，其特征在于，所述抗冻剂在每10ml常规稀释液中的添加量为100?200mg。
9.权利要求4所述的家畜精液冷冻保存稀释液用于保存牛精液，其特征在于，所述抗冻剂在每10ml常规稀释液中的添加量为150?250mg。
10.权利要求4所述的家畜精液冷冻保存稀释液用于保存羊精液，其特征在于，所述抗冻剂在每10ml常规稀释液中的添加量为50?lOOmg。
【文档编号】A01N1/02GK104161036SQ201410335943
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】李青旺, 胡靓华, 江中良 申请人:西北农林科技大学