一种黄绿绿僵菌mfyy090714及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种黄绿绿僵菌(Metarhizium?flavoviride)MFYY090714及其应用，其中，该黄绿绿僵菌MFYY090714于2014年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?NO.9020。该菌株是从白背飞虱体上分离得到的新菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其孢子悬浮液对白背飞虱成虫致病力较好，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛用于白背飞虱的防治实践中。
【专利说明】-种黄绿绿僵菌MFYY090714及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物农药【技术领域】，尤其涉及一种黄绿绿僵菌MFYY090714及其应 用。
【背景技术】
[0002] 白背飞虱是一种水稻重要害虫，常与褐飞虱和灰飞虱统称为稻飞虱。近年来白背 飞虱已成为我国西南地区，尤其在云南稻区稻飞虱的优势种，由于其有繁殖快、迁飞性和抗 药性强等特点，大发生时可造成水稻严重减产，甚至绝收，严重制约着水稻的生产。对白背 飞虱的防治一直以来都是害虫防治研究的重要内容，但长期以来主要依靠化学农药防治， 大量使用化学农药对人类健康和环境造成威胁，因而探求环境友好的白背飞虱生物防治替 代化学防治，极大减少化学农药的使用量已成为白背飞虱防治研究的重要课题。因白背飞 虱隶属于刺吸式口器害虫，而绿僵菌、白僵菌等虫生真菌是以独特的方式侵入，其分生孢子 主要通过表皮萌发侵入昆虫体壁，这为利用绿僵菌和白僵菌生物防治白背飞虱提供了基 础。黄绿绿僵菌（Metarhizium flavoviride)作为一种重要的昆虫病原真菌，属于半知菌亚 门丝孢纲绿僵菌属真菌，其寄主范围包括直翅目、同翅目、鞘翅目、半翅目、双翅目、膜翅目、 鳞翅目等昆虫目前英国已广泛用于蝗虫的生物防治。目前，有关稻田自然感染褐飞虱的黄 绿绿僵菌菌株及其致病性测定已有研究，但自然条件下侵染白背飞虱的黄绿绿僵菌及其对 白背飞虱的致病致病性及其防治应用方面的相关研究报道还未见到。
[0003] 黄绿绿僵菌遗传稳定性较好，对人、畜、禽类、植物均未发现毒害，本菌在白背飞虱 防治方面还未见报道。因此，在防治稻飞虱时又有很大的发展前景。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种黄绿绿僵菌（Metarhizium flavoviride)MFYY090714 及其应用，旨在以该黄绿绿僵菌高效、无毒、安全、无残留、使用简便地防治白背飞虱。
[0005] 本发明是这样实现的，一种黄绿绿僵菌（Metarhizium flavoviride)MFYY090714 已于2014年4月8日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)，保 藏号为No. 9020,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 邮编为100101。
[0006] 本发明从罹病白背飞虱成虫上分离获得黄绿绿僵菌野生菌株MFYY090714,将野生 菌株MFYY090714回接于白背飞虱成虫上复壮得到黄绿绿僵菌菌株，对该菌株按常规方法 进行单孢分离、培养得到纯的、致病力强的黄绿绿僵菌。在PDA培养基上菌落圆形展开，黄 绿色，气生菌丝绒毛状致密如絮，背面略显黄色。分生孢子梗疏松轮状分枝，其上着生1? 2个瓶梗，瓶梗杆状，与孢子梗成宽的夹角，顶部剧尖（7. 2_) 12. 0?4. 8 (-15. 6) X 1. 8? 3. 0 μ m，分生孢子单胞，广卵圆形，具不同的端部，大小为7. 2?9. 3 X 3. 0?4. 0 μ m，分生孢 子在瓶梗上形成向基性的链。该黄绿绿僵菌MFYY090714菌株属于快生长类型，菌落直径平 均每天都有lcm以上的生长速度。产孢快、产孢量大，在PDA培养基上培养第5天时产孢量 就可达IX 108孢子/ml。24小时孢子的萌发率达85%以上。在26°C时，该菌分生孢子对 白背飞虱成虫致死中浓度（LC5Q)为3. 43X 105孢子/ml，LT5Q为4. 15天。
[0007] 本发明的有益效果为：该菌株是从白背飞虱体上分离得到的新菌株，培养比较简 单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其孢子悬浮液对白背飞虱成虫致病力较好，环保无 污染、不易产生抗药性，可以广泛用于白背飞虱的防治实践中。
【具体实施方式】
[0008] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0009] 实施例一、病原菌的分离、鉴定
[0010] 1、材料与方法
[0011] 1. 1 材料
[0012] 在云南省元阳梯田稻田采集到被一种虫生真菌侵染后的罹病白背飞虱Sogatella furcifera(Horv0th)成虫。
[0013] 马铃薯葡萄糖（PDA)培养基：去皮马铃薯200g，切成小块，加水lL，20min后纱布 过滤，滤液中加葡萄糖20g、琼脂15?20g，加热溶化，定溶至1000mL无菌操作条件：所有的 器皿和用具均经高温灭菌锅（121°C，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。
[0014] 培养条件：置于26°C光照（12L :12D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到试管 PDA斜面，培养3?4天，转入4°C冰箱储存。
[0015] 1.2病原菌的分离和纯化
[0016] 分离：从罹病白背飞虱成虫尸体上分离病原菌。将白背飞虱成虫尸体按顺序依次 经过70%酒精浸泡30秒、再经过0. 1 %升汞溶液浸泡3分钟（彻底消毒）、最后用无菌水冲 洗三次，将处理好的白背飞虱成虫尸体接种于PDA培养基上。在温度为26°C条件下培养， 长出菌丝后按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、致病力强的黄绿绿僵菌菌株，转移到 PDA斜面上生长3?4天，在4°C冰箱储存。
[0017] 复壮：将分离到的菌株在PDA培养基上培养7?10天后，加入含1 %吐温-80的无 菌水收集孢子，后转移到烧杯内，用玻璃棒搅拌均匀，得到适当浓度（1〇8孢子/ml)的孢子 悬浮液，用小型喷雾器均匀喷于白背飞虱成虫体表（以虫体表面湿润为度），保持相对湿度 90%以上。收集死虫并保湿，得到的成虫虫尸再按以上方法分离得到致病力更强的菌株。
[0018] 纯化：挑取培养基上菌落上的菌丝，再次接种在新的培养基上。如此多培养几代， 菌株就得到了纯化。
[0019] 1.3病原菌的鉴定
[0020] 根据病原菌的培养性状、菌丝和分生孢子的形态进行鉴定。在40X 10倍生物显微 镜，镜检菌丝和分生孢子的形态。
[0021] 2、结果
[0022] 从被虫生真菌自然侵染的白背飞虱成虫虫体上分离获得野生菌株，在马铃薯葡 萄糖琼脂培养基（PDA)上培养，并回接于白背飞虱成虫复壮获得一菌株，对该菌株进行单 菌丝分离获得纯化的菌株，即黄绿僵菌（Metarhizium flavoviride)MFYY090714，CGMCC No. 9020〇
[0023] 在PDA培养基上菌落圆形展开，黄绿色，气生菌丝绒毛状致密如絮，背面略显黄 色。分生孢子梗疏松轮状分枝，其上着生1?2个瓶梗，瓶梗杆状，与孢子梗成宽的夹角，顶 部剧尖（7. 2_) 12. 0?4. 8(-15. 6) X 1. 8?3. 0 μ m，分生孢子单胞，广卵圆形，具不同的端 部，大小为7. 2?9. 3X3. 0?4. 0 μ m，分生孢子在瓶梗上形成向基性的链。
[0024] 根据观察到的菌落、菌丝和孢子形态，与《昆虫真菌学》上的有关黄绿绿僵菌的形 态特征描述和图谱进行对比分析，鉴定为黄绿绿僵菌。
[0025] 实施例二、黄绿绿僵菌纯化菌株生物学特性
[0026] 1、材料与方法
[0027] 1. 1供试菌株选择纯化后长得均匀且生长旺盛的一皿作为供试菌株。取菌丝再 次接种到PDA培养基上，于26 °C的恒温光照（12L:12D)培养箱中培养。
[0028] 1. 2菌落生长速率和产孢量的测定将事先培养好的黄绿绿僵菌取一皿用8mm 的打孔器打孔取菌，接种于新的培养基上，做三个重复，置于26°C的恒温光照（12D:12L)培 养箱中培养，每天定时测定其直径并记录，直到菌落长满培养基为止。用直径为8_的打孔 器在培养基相同的位置取菌饼，加1 %吐温-80和20ml无菌水，将孢子洗下，制成孢子悬浮 液，用血球计数板测定产孢量。
[0029] 1. 3孢子萌发率的测定将菌株培养5?10天，分别用无菌水收集分生孢子，制 成悬浮液，用带凹槽的载玻片测定孢子萌发率。将孢子悬浮液直接滴在无菌载玻片上，置于 底铺滤纸的培养皿内，滴加几滴无菌水保持湿度在100% RH，培养24小时后镜检，每个处理 三次重复。
[0030] 2、结果
[0031] 由表1可以看出，黄绿绿僵菌菌株MFYY090714属于快速生长的类型。第一天生长 缓慢，是因为菌株刚接种时需要一段时间适应，菌落从第2天生长速度较快。由表2可以看 出，在PDA培养基上培养至第5天产孢量就可达IX 108孢子/ml。产孢量较高。由表3可 以看出，24小时孢子的萌发率可达85%以上。这些均说明该菌株生长繁殖较快，生物学特 性良好。
[0032] 表1菌落直径的生长速度
[0033]
【权利要求】
1. 一种黄绿绿僵菌（Metarhizium flavoviride)MFYY090714,于 2014 年 4 月 8 日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 9020。
2. 权利要求1所述的黄绿绿僵菌MFYY090714在白背飞虱防治方面的应用。
【文档编号】A01N63/04GK104120084SQ201410335748
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】陈斌, 杜广祖, 肖关丽, 和淑琪, 张立敏, 桂富荣, 李正跃, 严乃胜 申请人:云南农业大学