尤韦可拟盘多毛孢代谢产物在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物【技术领域】，本发明所述的牡蒿内生真菌是从贵州省贵阳市郊区采集的牡蒿植物活体中采用内生真菌分离技术分离获得的，经微生物分类学鉴定，命名为尤韦可拟盘多毛孢(Pestalotiopsis?uvicola)GMH31，该菌株已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期2014年6月30日，保藏登记号CCTCCNO:M2014303。本发明最显著的特征是：该菌株发酵菌丝体能分泌多种天然活性成分，具有广谱抗肿瘤等药效作用，是新型天然活性药物的重要微生物资源。
【专利说明】尤韦可拟盘多毛孢代谢产物在制备抗肿瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】，尤其是涉及一株来源于药用植物牡蒿的拟盘多毛孢属内生真菌尤韦可拟盘多毛孢(Pestalot1psis uvicola)GMH31及其代谢产物在医药中的应用。
【背景技术】
[0002]植物内生真菌(fungal endophyte)是指生活史的一定阶段或全部阶段生活与健康植物各组织合格器官内的真菌。它们与宿主植物通过互作形成了紧密的共生关系，可以促进植物的生长，提供植物应对胁迫的适应能力，有的植物内生真菌还具有药用价值。从植物内生真菌中寻找和发现活性化合物已成为国内外研究的又一热点。如中国专利文献CN201310194836.5公开了一株龙胆中分离得到的内生真菌(Metarrhizium) LD421,可用于防治龙胆叶枯病；专利申请CN201210067829.4则公开了从银杏根、茎、叶等组织中分离得到的内生真菌腐皮镰孢菌T-7，对辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、苹果腐烂病菌等具有很好的抑制作用。
[0003]牡蒿(Artemisia japonica)为菊科蒿属植物,其味苦、微甘、性凉。民间又称土紫胡(《陆川草本》)、胃痛灵、熊掌草，以全草入药。具有清热、凉血、解毒、健胃止血功效，主要用于治疗感冒发热，中暑、疟疾、肺结核潮热、高血压病、五痨七伤、大小便不通和毒蛇咬伤等。同时也有记载牡蒿为药食两用植物，含有多种活性物质，具有免疫、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂保肝以及延缓衰老等多种生理功能。另外，牡蒿还可用于制备生物农药，作为杀虫剂使用。
[0004]目前在农业生产过程中控制农作物病虫草害的主要手段是化学农药防治，其对减轻病虫草害，保证农作物丰产丰收起到积极的作用，但是由于自然界生物之间的相互制约相互依存，现在已不建议过分依赖化学农药在进行病害的处理。因此，对植物内生真菌的研究，利用植物内生真菌与宿主植物生物活性共生的关系，来筛选具有高生物活性的内生真菌，进一步获得活性产物，是今年来研究的一大热点。但是，对于某一宿主植物，究竟何种内生真菌或哪几类内生真菌具有抗病原微生物活性，且各内生真菌中哪种菌活性最高，分离纯化是否容易，发酵过程是否复杂等等，都是需要进行大量研究加以证实的，目前尚未发现牡蒿内生真菌及其分离培养和抗病原微生物活性、药用活性应用的具体报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对化学药品不安全与微生物源药品种类较少的不足，提供一种从药用植物牡蒿中分离筛选出的内生真菌-尤韦可拟盘多毛孢(Pestalot1psis
uvicola)。
[0006]本发明所述内生真菌，是从贵州省贵阳市郊区的药用植物牡蒿(Artemisiajaponica)中分离获得的，命名为内生尤韦可拟盘多毛孢(Pestalot1psis uvicola)GMH31，并对该菌株的发酵代谢产物进行了多种生物活性研究。该发明为微生物源农药和医药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株。
[0007]本发明技术方案如下:
[0008]本发明尤韦可拟盘多毛孢的分离、筛选与鉴定:
[0009]是于2011年8月在贵州省贵阳市郊区采集的牡蒿叶片中，经分离、纯化、培养、发酵和活性测定等步骤获得并保存；经微生物分类学鉴定为尤韦可拟盘多毛孢(Pestalot1psis uvicola),定名为尤韦可拟盘多毛抱(Pestalot1psis uvicola) GMH31。该菌株已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期2014年6月30日，保藏登记号CCTCCN0:M2014303，地址湖北省武汉市武昌珞珈山。
[0010]具体的分离培养方法为:
[0011](I)牡蒿植物组织的准备:采集牡蒿的叶组织，用自来水冲洗，除去样品表面的表生微生物，然后放于干净的纱布上风吹晾干；
[0012](2)表明消毒及无菌检测:晾干后的组织块剪成适宜大小，用灭菌蒸馏水冲洗干净，叶片消毒采用75%乙醇浸泡l-2min、0.1% HgCl2溶液浸泡3_4min，然后用灭菌蒸馏水冲洗至消毒液无残留，用灭菌滤纸吸干组织段表面残留水滴后，切成直径4?6_大小的组织切段；
[0013](3)内生真菌的分离纯化:将步骤(2)消毒后的组织切段接种于含有硫酸链霉素(100 μ g.mL—1)和青霉素(50 μ g.mL—1)的PDA培养基平板上，封口后于25_30°C恒温培养2?7天，至菌丝体从组织块中长出，采用尖端菌丝挑取法，将菌丝转移至纯化PDA培养基平板上，于25-30°C下进行纯化培养5?9天，长出完整菌落，即为牡蒿内生真菌。
[0014]优选地，所述步骤(3)中培养温度为28°C，平板培养，纯化培养时间为7天。
[0015]该牡蒿内生真菌命名为尤韦可拟盘多毛孢GMH31，其固体培养特征为:菌落在PDA平板上28°C培养8-9天扩展至直径为9cm，菌落白色棉絮状，轮状扩展不明显，背面淡橘黄色，无轮纹，子实体墨汁状，颗粒较大，分布比较稀疏。显微形态特征:分生孢子盘黑色，近球状，初埋生寄主表皮下，成熟后突破表皮外露，呈粒点状；分生孢子5细胞，两端细胞无色(呈圆锥形或三角形)，中间细胞呈橄榄色至褐色(9.7?12.6 μ m)，近纺锤形，直立，壁厚，大小为19.7?23.5X5.5?6.6 μ m ;附属丝着生于分生孢子的顶端，为2?3根,角度开张，较细长，长度为5.9?6.5 μ m,底部无色,三角形,尾丝短或无。见图1、图2。
[0016]菌株GMH31的分子生物学特征:采用分子生物学PCR技术，DNA序列测定分析，菌株GMH31的ITS rDNA基因组由495个碱基(bp)组成。以ITS rDNA序列为基础构建系统发育树，该菌为尤韦可拟盘多毛孢，见图3。
[0017]本发明的另一目的是提供利用该菌株发酵液代谢产物防治植物真菌病害的方法。
[0018]上述目的通过以下技术方案来实现:
[0019]一种防治猕猴桃褐腐病和辣椒疫病等植物真菌病害的微生物代谢产物的制备方法，按以下步骤进行:
[0020](I)菌种的活化培养:将分离保存的尤韦可拟盘多毛孢GMH31菌种移至马铃薯葡萄糖PDA固体平板上，在28 ± I °C条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为7mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；
[0021](2)液体发酵培养:发酵培养液为每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖 20g、酵母膏 5g、蛋白胨 10g、KH2PO40.5g、CaC0315g、MgSO4.7Η200.3g，每 500mL 三角瓶装发酵培养液10mL ;配制后121^灭菌20!^11，待冷却至401:在无菌条件下挑取I直径为7mm菌饼，在28 土 1°C条件下，静置发酵培养28-35天；
[0022](3)发酵液提取:发酵完毕后收集发酵液，加入1-3倍体积的乙酸乙酯萃取，取下层溶液，再用1-2倍体积的正丁醇萃取，分层后取上层液，在真空条件下浓缩至浸膏，得正丁醇发酵液萃取物。
[0023]本发明的再一目的是提供该菌株发酵菌丝体代谢产物在制备抗肿瘤等药物中的应用。
[0024]上述目的通过以下技术方案来实现:
[0025]一种具有抗肿瘤活性的菌丝体代谢产物的制备方法，按以下步骤进行:
[0026](I)菌种的活化培养:将分离保存的尤韦可拟盘多毛孢GMH31菌种移至马铃薯葡萄糖PDA固体平板上，在28 ± I °C条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为7mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；
[0027](2)液体发酵培养:发酵培养液为每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖 20g、酵母膏 5g、蛋白胨 10g、KH2PO40.5g、CaC0315g、MgSO4.7Η200.3g，每 500mL 三角瓶装发酵培养液10mL ;配制后121^灭菌20!^11，待冷却至401:在无菌条件下挑取I直径为7mm菌饼，在28 土 1°C条件下，静置发酵培养28-35天；
[0028](3)菌丝体提取:发酵完毕后收集菌丝体，加入浓度为30-90%丙酮水溶液，使菌丝体在丙酮水溶液中的浓度小于等于0.50g/L，在功率为40KHz、30min/次的条件下超声萃取2-5次，然后在同等条件下再加入等体积乙酸乙酯超声萃取2-5次，过滤，收集上层乙酸乙酯溶液，在真空条件下浓缩至浸膏，得乙酸乙酯菌丝体萃取物。
[0029]本发明的有益效果:
[0030]一是本发明从药用植物牡蒿叶片中分离筛选出代谢物对部分植物真菌病害病原菌和肿瘤细胞具有较强抑制作用的尤韦可拟盘多毛孢GMH31，这为农业上防治植物真菌病害病原菌和医药上抗恶性肿瘤新药源的开拓提供了一种微生物菌株。
[0031]二是本发明提供了利用尤韦可拟盘多毛孢GMH31发酵获得活性发酵液代谢产物的方法；该代谢产物可应用于植物真菌病害的防治，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径。
[0032]三是本发明提供了利用尤韦可拟盘多毛孢GMH31发酵获得活性菌丝体代谢产物的方法；该代谢产物可应用于抗肿瘤药物的制备，为医用药物新来源的开发增添了新的途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为尤韦可拟盘多毛抱(Pestalot1psis uvicola)GMH31菌株的平板图。
[0034]图2为尤韦可拟盘多毛孢(Pestalot1psis uvicola)GMH31菌株的分生孢子图。
[0035]图3为尤韦可拟盘多毛抱(Pestalot1psis uvicola)GMH31菌株的基因树图。
【具体实施方式】
[0036]为了使本领域普通技术人员更好的理解本发明，本 申请人:进行了一系列实验研究，以证明本发明的效果。
[0037]下面，举出实施例对本发明进一步描述，但本发明并不限于下述的实施例。
[0038]实施例1:(尤韦可拟盘多毛孢GMH31的分离与筛选)
[0039]本发明于2011年8月在贵州省贵阳市郊区采集药用植物——牡蒿的健康叶片，经表面消毒、内生真菌分离、培养、发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌活性菌株和肿瘤细胞株的筛选等步骤，从中获得尤韦可拟盘多毛孢GMH31，保存。
[0040]具体的分离培养方法为:(I)牡蒿植物组织的准备:采集牡蒿的叶组织，用自来水冲洗，除去样品表面的表生微生物，然后放于干净的纱布上风吹晾干；
[0041](2)表明消毒及无菌检测:晾干后的组织块剪成适宜大小，用灭菌蒸馏水冲洗干净，叶片消毒采用75%乙醇浸泡lmin、0.1 % HgCl2溶液浸泡3min，然后用灭菌蒸馏水冲洗至消毒液无残留，用灭菌滤纸吸干组织段表面残留水滴后，切成直径4?6_大小的组织切段；
[0042](3)内生真菌的分离纯化:将步骤(2)消毒后的组织切段接种于含有硫酸链霉素(100 μ g -πιΓ1)和青霉素(50 μ g -πιΓ1)的PDA培养基平板上，封口后于28°C恒温培养5天，至菌丝体从组织块中长出，采用尖端菌丝挑取法，将菌丝转移至纯化PDA培养基平板上，于28°C下进行纯化培养7天，长出完整菌落，即为牡蒿内生真菌。
[0043]尤韦可拟盘多毛孢GMH31抑菌活性测定:
[0044]取经0.22 μ m膜过滤的发酵液ImL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50°C的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面分别放I个直径为7mm的猕猴桃褐腐病菌(Sclerotinia sclerot1rum)或辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)等供试菌菌饼，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置培养箱中28°C培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率:1(%)=[(对照菌落直径一处理菌落直径)/ (对照菌落直径-7) ] X 100%。
[0045]测定结果表明:尤韦可拟盘多毛孢GMH31代谢产物对猕猴桃褐腐病菌和辣椒疫霉菌的抑制率分别为82.8%和86.9%。
[0046]尤韦可拟盘多毛孢GMH31抑制肿瘤细胞株生长测定:
[0047]将肿瘤细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100 μ L，标准条件培养12h后，分别加入含有对照或发酵菌丝体提取物的培养液(浓度分别为20 μ g/mL和200 μ g/mL)。标准条件分别培养12、24、48、72、96h，于培养结束前4h，各孔加入0.5%的MTT溶液20 μ L。培养结束后，弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μ L终止反应，于自动酶标仪上，测定各孔在波长492nm处的光密度值(0D值)，计算细胞抑制率:1 (% ) = [I —加药孔OD值/对照孔OD值]X 100%。抑制率>50%的为具有肿瘤细胞毒活性的菌株。
[0048]测定结果表明:浓度为20 μ g/mL的尤韦可拟盘多毛孢GMH31代谢产物，在72h时，对小鼠腹水型肝癌细胞H22、小鼠腹水型宫颈癌细胞U14和小鼠腹水型肉瘤细胞S18tl的抑制率分别为 86.1%,92.4%和 77.9%。
[0049]实施例2:(尤韦可拟盘多毛孢GMH31发酵代谢产物的制备方法)
[0050]按以下步骤进行:
[0051](I)菌种的活化培养:将分离保存的尤韦可拟盘多毛孢GMH31菌种移至马铃薯葡萄糖琼脂PDA固体平板上，在28 ± I °C条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为7mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；
[0052](2)液体发酵培养:发酵培养液为每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖 20g、酵母膏 5g、蛋白胨 10g、KH2PO40.5g、CaC0315g、MgSO4.7H200.3g，每 300mL 三角瓶装发酵培养液10mL ;配制后121^灭菌20!^11，待冷却至401:在无菌条件下挑取I直径为7mm的菌饼，在28 ± I °C条件下，静置发酵培养30天；
[0053](3)发酵液提取:发酵完毕后收集发酵液，加入等体积乙酸乙酯萃取，取下层溶液，再用等体积正丁醇萃取，分层后取上层液，在真空条件下浓缩至浸膏，得正丁醇发酵液萃取物；
[0054](4)菌丝体提取:发酵完毕后收集菌丝体，加入浓度为80%丙酮水溶液，使菌丝体在丙酮水溶液中的浓度小于等于0.50g/L，在功率为40KHz、30min/次的条件下超声萃取4次，然后在同等条件下再加入等体积乙酸乙酯超声萃取4次，过滤，收集上层乙酸乙酯溶液，在真空条件下浓缩至浸膏，得乙酸乙酯菌丝体萃取物。
[0055]以下实施例3中所述的尤韦可拟盘多毛孢GMH31代谢产物为实施例2下方法(3)中所制备的正丁醇发酵液萃取物；所述产品的百分含量为质量/体积百分比。
[0056]实施例3:(尤韦可拟盘多毛孢GMH31发酵液代谢产物对猕猴桃褐腐病菌和辣椒疫霉菌的抑制作用)
[0057](I)准确称取尤韦可拟盘多毛孢GMH31正丁醇发酵液萃取物0.1g,加入1mL体积的无菌水，超声波震荡充分溶解，最终配置成浓度为10g/L的母液；
[0058](2)抑菌活性测定:取上述母液分别稀释成浓度为1000mg/L和500mg/L的溶液，取各浓度溶液ImL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50°C的PDA培养基迅速混匀(尤韦可拟盘多毛孢GMH31代谢产物终浓度为100mg/L和50mg/L)，冷却后在每个培养基平面分别放I个直径为7mm的猕猴桃褐腐病菌和辣椒疫霉菌菌饼，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置培养箱中28°C培养36h，以常规化学药剂和无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率:1(%)=[(对照菌落直径一处理菌落直径)/ (对照菌落直径-7) ] X 100 %。
[0059](3)本发明产品与常规农药防治效果对比试验:试验结果见表1。从表1看出，尤韦可拟盘多毛孢GMH31代谢产物抑制效果较常规化学药剂略优，且安全。
[0060]表1尤韦可拟盘多毛孢GMH31代谢产物对供试病原真菌的抑制效果
[0061]
【权利要求】
1.尤韦可拟盘多毛孢(Pestalot1psisuvicola)GMH31代谢产物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的尤韦可拟盘多毛孢GMH31在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏登记号为CCTCCNO:M2014303。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述代谢产物按以下方法制备: (1)菌种的活化培养:将分离保存的尤韦可拟盘多毛孢GMH31菌种移至马铃薯葡萄糖PDA固体平板上，在28 ± I °C条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为7mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用； (2)液体发酵培养:发酵培养液为每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖20g、酵母膏 5g、蛋白胨 10g、KH2P040.5g、CaC0315g、MgS04.7Η200.3g，每 500mL 三角瓶装发酵培养液10mL ;配制后121°C灭菌20min，待冷却至40°C在无菌条件下挑取I直径为7mm菌饼，在28 土 1°C条件下，静置发酵培养28-35天； (3)菌丝体提取:发酵完毕后收集菌丝体，加入浓度为30-90%丙酮水溶液，使菌丝体在丙酮水溶液中的浓度小于等于0.50g/L，在功率为40KHz、30min/次的条件下超声萃取2-5次，然后在同等条件下再加入等体积乙酸乙酯超声萃取2-5次，过滤，收集上层乙酸乙酯溶液，在真空条件下浓缩至浸膏，得乙酸乙酯菌丝体萃取物。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述代谢产物按以下方法制备: (1)菌种的活化培养:将分离保存的尤韦可拟盘多毛孢GMH31菌种移至马铃薯葡萄糖PDA固体平板上，在28 ± I °C条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为7mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用； (2)液体发酵培养:发酵培养液为每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖20g、酵母膏 5g、蛋白胨 10g、KH2P040.5g、CaC0315g、MgS04.7Η200.3g，每 500mL 三角瓶装发酵培养液10mL ;配制后121°C灭菌20min，待冷却至40°C在无菌条件下挑取I直径为7mm菌饼，在28 °C条件下，静置发酵培养30天； (3)菌丝体提取:发酵完毕后收集菌丝体，加入浓度为80%丙酮水溶液，使菌丝体在丙酮水溶液中的浓度小于等于0.50g/L，在功率为40KHz、30min/次的条件下超声萃取3次，然后在同等条件下再加入等体积乙酸乙酯超声萃取3次，过滤，收集上层乙酸乙酯溶液，在真空条件下浓缩至浸膏，得乙酸乙酯菌丝体萃取物。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为小鼠腹水型肝癌细胞H22、小鼠腹水型宫颈癌细胞U14或小鼠腹水型肉瘤细胞S180。
【文档编号】A01N63/04GK104161777SQ201410335854
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】钱一鑫, 康冀川, 王鲁 申请人:贵州大学