专利名称：一种脂肪酶的制作方法
一种脂肪酶技术领域
本发明属于微生物工程生物技术领域，具体涉及一种脂肪酶及重组表达工程菌株，即筛选的脂肪酶在毕赤酵母中的表达。
背景技术：
脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。
脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富 (Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用P H、 作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。
脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、 最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同(Veeraragavan等)。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性， 对底物有特异性(Schmid等；Kazlauskas等)。
脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。发明内容
本发明的目的是提供一种新型脂肪酶及其重组表达工程菌。即利用基因工程手段，筛选出新的脂肪酶基因，并转化入毕赤酵母中，构建毕赤酵母工程菌。构建的工程菌能高效表达脂肪酶基因，且所产脂肪酶的酶学性质优良，可广泛用作饲料添加剂，提高饲料中油脂的利用率。
本发明一个方面提供一种新型的脂肪酶，其特征在于
I)其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶；
2)其氨基酸序列与SEQ ID NO:1同源性高于80%的脂肪酶；
3)在I)或2)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。
本发明另一方面提供了编码上述脂肪酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。
本发明的脂肪酶，去掉信号肽后的氨基酸序列为SEQ ID NO: 3，其核苷酸的序列为 SEQ ID NO: 4。
本发明提供了一种表达载体，其包含上述编码基酸序列为SEQ ID NO: 3的脂肪酶的核苷酸。
本发明另一方面提供了一种表达宿主细胞，其携带有表达上述脂肪酶基因的表达载体。
上述表达宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)。
本发明脂肪酶用于制备饲料添加剂。
本发明的脂肪酶能显著提高饲料中油脂类物质的利用率。日粮中降低75 Kcal/ kg油脂添加量后，通过添加脂肪酶，肉仔鸡的生产性能优于负对照，且与正对照几乎一致， 所以能显著降低饲料成本。而构建的毕赤酵母工程菌能够高效表达本发明的脂肪酶，酶活水平达到229 u/mL·重组表达的脂肪酶最适作用温度为40°C,最适pH为4. O。
图1 :本发明构建的重组表达载体质粒图谱。
图2 :毕赤酵母工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指为重组表达的脂肪酶。
图3 :重组表达的脂肪酶温度作用曲线图。
图4 :重组表达的脂肪酶pH作用曲线图。
具体实施方式
以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。
实施例1斜卧青霉脂肪酶基因的克隆
1.1总DNA的提取
将斜卧青霉(P. decumberns)过夜培养,取适量菌体置于离心管中，13000 rpm 离心 5 min，弃上清；加入 400 μ I 抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65°C水浴 20min后，加入200 μ I IOM NH4AC,冰浴IOmin ;13000rpm离心lOmin，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，_20°C放置30min ； 13000 rpm离心lOmin，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干,加入水溶解,于-20°C保存。
1. 2总RNA的制备
OMEGA公司的E. Z. N. A. Fungal RNA Kit制备斜卧青霉的mRNA，其制备过程参照试剂盒的操作手册。
1. 3基因克隆
以1.1中提取的基因组总DNA为模板，分别利用引物对(ATGATGATCAATTGGAAG和 TCAAATATGGAAAGACGC)进行 PCR 扩增。PCR 扩增条件为 94°C 5min ；94°C 30S ；55°C 30S, 72°C 2min 30个循环；72°C IOmin0利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
以1. 2中提取的基因组总RNA为模板，扩增其cDNA序列。采用TaKaRa公司的 PrimeScript RT-PCR Kit 扩增 cDNA 基因序列。
1. 4测序分析
将1. 3中回收的扩增产物分别连接到pMD18 T-载体，相应的克隆载体分别命名为 pT-lipl和pT-lip2，把阳性克隆送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果为 Lip I和Lip 2比对分析显不该基因序列不含有内含子，Lipl和Lip 2的核昔酸序列均为 SEQ ID NO: 2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
经NCBI 的 BLAST 比对发现，SEQ ID NO:1 与 Aspergillus flavus NRRL3357 菌的胞外脂肪酶氨基酸序列的同源性最高，同源性为73%。该蛋白属于酯酶-脂肪酶家族，具有脂肪酶保守催化和结构域。
1. 5信号肽预测
利用网站http://smart, embl-heidelberg. de/对 SEQ ID NO:1 的氨基酸序列进行预测分析，结果显示序列的前18个氨基酸为信号肽，去除信号肽后的氨基酸序列为SEQ ID NO: 3，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 4。
实施例2表达去掉信号肽的脂肪酶基因的工程菌的构建
2.1毕赤酵母工程菌的构建
以质粒pT- Lip 2 为模板，利用引物(GGGGTACCATGATGATCAATTGGAAG 和 GCTCTAGATCAAATATGGAAAGACGC)进行 PCR 扩增，PCR 扩增条件是 94°C 5min ；94°C 30S ；55°C 30S，72°C 2min 30个循环；72°C IOmin0扩增产物凝胶回收后，先进行XbaI和Kpn I双酶切。同样，对表达质粒PPIC9K也进行XbaI和Kpn I双酶切。用T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表达载体4°C连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌DH5a。相应的阳性克隆表达质粒命名为pPIC-Lip,该质粒图谱如图1所示。
表达质粒pPIC-Lip用Sac I酶切电泳鉴定后，经乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度， 以3yg/μ L浓度稀释质粒片段保存备用。制备毕赤酵母GSl 15电转化感受态细胞，最后重悬于I mL预冷的电泳缓冲液中(含ImM MgCl2, IOmM HEPES, 250mM蔗糖，pH 7.8)。在 80μ L感受态细胞中加入5μ L线性化重组质粒；电转化(条件为1500V、200Q、25yF);最后涂布于丽平板(丽培养基组分1. 34%ΥΝΒ，4Χ 1(Γ5%生物素，O. 5%甲醇)，挑选重组菌株。 将其中一株重组菌株命名为Pichia pastoris Pi_Lip，测序结果表明插入的片段为SEQ ID NO: 4，表明扩增中没有出现错误。
实施例3发酵和酶学性质测定
3.1毕赤酵母工程菌摇瓶发酵
将上述毕赤酵母工程菌(Pichia pastoris P1-Lip)接种于5ml BMGY ( 1%酵母提取物，2%蛋白陈，1. 34 % YNB, 4X10_5%生物素，1%甘油)，30°C培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50ml BMMY诱导培养基(I %酵母提取物，2%蛋白陈，I· 34 % YNB, 4X10_5% 生物素，O. 5%甲醇)，每12小时补加50 μ L甲醇，诱导培养5天，取上清液，测定其酶活水平达到 229u/ml。
脂肪酶活力
Ig固体酶粉(或Iml液体酶),在一定温度和pH条件下，Imin水解底物产生I μ mo I 的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。
酶活测定方法
取两个IOOml三角瓶，分别于空白瓶(A)和样品瓶⑶中各加入底物溶液4. OOml 和磷酸缓冲液5. 00ml，再于A瓶中假如95%乙醇15. 00ml，于40°C ±0. 2°C水浴中预热5min， 然后于A、B瓶中各加待测酶液1. 00ml，立即混匀计时，准确反应15min后，于B瓶中立即补加95%乙醇15. OOml终止反应，取出；于空白和样品溶液中各加酚酞指示液两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保存30s，不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。
脂肪酶的酶活力按下列公式计算
权利要求
1.一种脂肪酶，其特征在于 1)其氨基酸序列为SEQID NO:1的脂肪酶； 2)其氨基酸序列与SEQID NO:1同源性高于80%的脂肪酶； 3)在I)或2)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。
2.编码权利要求1所述的脂肪酶的基因，其核苷酸序列为SEQID NO: 2。
3.一种脂肪酶，其特征在于所述的脂肪酶是将权利要求1所述的脂肪酶去掉信号肽后形成的，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 3。
4.编码权利要求3所述的脂肪酶的基因，其核苷酸序列为SEQID NO: 4。
5.一种表达载体，所述的表达载体用于表达权利要求3所述的脂肪酶。
6.如权利要求5所述的表达载体，其携带有权利要求4所述的基因。
7.—种表达宿主细胞，其携带有权利要求5所述的表达载体。
8.如权利要求7所述的宿主细胞,所述的细胞为毕赤酵母(Pichiapastoris)。
9.权利要求1或3所述的脂肪酶在制备饲料添加剂中的应用。
10.一种饲料添加剂，所述的饲料添加剂为权利要求3所述的脂肪酶。
全文摘要
本发明涉及一种新型的脂肪酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。本发明的脂肪酶，去掉信号肽后的氨基酸序列为SEQ ID NO: 3。本发明还提供了一种毕赤酵母细胞，其携带有表达上述脂肪酶基因的表达载体。本发明的脂肪酶能显著提高饲料中油脂类物质的利用率。日粮中降低75Kcal/kg油脂添加量后，通过添加脂肪酶，肉仔鸡的生产性能优于负对照，且与正对照几乎一致，所以能显著降低饲料成本。而构建的毕赤酵母工程菌能够高效表达本发明的脂肪酶，酶活水平达到229u/ml。重组表达的脂肪酶最适作用温度为40℃，最适pH为4.0。
文档编号A23K1/165GK103013950SQ20121049982
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者黄亦钧, 赵倩, 许韡, 刘艳萍, 王华明, 张慧丹, 曲音波, 刘国栋, 陈梅 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司