控制植物叶片转绿的基因及其使用方法和应用的制作方法
【专利摘要】控制植物叶片转绿的基因及其使用方法和应用，本发明公开了通过促进或抑制EMB2279基因或其蛋白来调节植物叶绿体成熟的方法及其应用。所述方法可用于控制植物叶片转绿性状。本发明的EMB2279基因或其蛋白及方法对于植物培植领域具有广泛的应用价值，为转基因技术改良农作物或者园艺植物提供了很好的基因资源。
【专利说明】控制植物叶片转绿的基因及其使用方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】。具体地说，本发明涉及利用EMB2279基因及其蛋白控制植物叶片转绿的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]众所周知，叶绿体是植物进行光合作用的场所，因此，改进叶绿体的功能，例如增强或促进叶绿体的活性对于提高农作物，特别是粮食作物产量或者经济作物产量有极其重要的意义。
[0003]目前，农业生产中主要是通过延缓叶绿体衰老的途径来提高作物产量。由于叶绿体发育受到包括低温、阴雨等环境因子的影响，如果植物能在各种逆境条件下都能保障叶绿体顺利发育，必将有利于植物的生长。但实际生产中尚未展开这样的应用研究。其次，各种不同类型的质体，包括叶绿体也是许多营养物质积累的场所，例如氨基酸、维生素、抗氧化剂等等，因此调控叶绿体发育也与品质密切相关。但是，迄今还没有运用生物技术调控叶绿体发育来提高作物品质的先例。例如，某些蔬菜栽培中，为了使叶绿体退化变成黄化质体，往往采用，诸如培土、遮光等传统手段，而这些传统的栽培措施往往具有成本过高、操作繁琐、结果不稳定、成功率不高等等缺点。因此，如果能通过调控植物体内本身关键基因表达就能改变叶绿体发育的状态，就可以简单、高效实现作物的品质改良。
[0004]另外，在园艺观赏植物中，观叶植物也是越来越受到人们的重视。目前，这些观赏植物都是从自然突变体或者通过人工诱变后筛选获得的突变体。随着生物技术的不断发展，通过转基因定向培育植物新品种具有快速、效率高等特点。
[0005]因此，本领域急需能够控制叶绿体的成熟程度，进而调节植物的产量以及叶片颜色等各种性状的方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供调控植物叶绿体成熟的方法。
[0007]在第一方面，本发明提供EMB2279基因或其蛋白在调控植物叶绿体成熟中的应用。
[0008]在优选的实施方式中，所述植物包括十字花科、禾本科、豆科、脂麻科、菊科、藜科、山茶科、菌草科、梧桐科、爺科、五加科、多孔菌科、百合科、壳斗科、棕榈科、龙舌兰科。
[0009]在优选的实施方式中，所述植物包括:拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小麦、水稻、玉米、燕麦、黑麦、大麦、粟、高粱、青稞、棉花、麻类、花生、油菜、芝麻、大豆、向日葵、甜菜、甘蔗、茶叶、咖啡豆、可可、烟草、人参、灵芝、贝母、橡胶、椰子、油棕和剑麻。
[0010]在优选的实施方式中，所述应用是调节植物叶片颜色。
[0011]在优选的实施方式中，EMB2279蛋白包括
[0012](a)如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的蛋白；或
[0013](b)将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所述蛋白的功能的由(a)衍生的蛋白。
[0014]在第二方面，本发明提供调控植物叶绿体成熟的方法，所述方法包括以下步骤:
[0015]a)将促进或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达的物质给予植物、植物种子、植物细胞、组织或器官；和
[0016]b)培养步骤a)获得的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官。
[0017]在优选的实施方式中，所述促进EMB2279基因或其蛋白的活性或表达是指与对照相比，EMB2279基因或其蛋白的表达量升高或过表达，或表达活性更高的蛋白变体；所述拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达是指与对照相比，EMB2279基因或其蛋白的表达量降低或不表达，或表达活性降低或无活性的EMB2279蛋白。
[0018]在优选的实施方式中，所述促进或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达的物质包括:EMB2279基因本身、EMB2279基因的反义RNA或EMB2279蛋白的抗体。
[0019]在优选的实施方式中，拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达的物质是SEQ IDNO:3 所不的 microRNA。
[0020]在另一优选的实施方式中，所述步骤a)是将编码EMB2279蛋白的多核苷酸转入植物、植物种子、植物细胞、组织或器官，获得转化入编码EMB2279蛋白的多核苷酸的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官。
[0021]在进一步优选的实施方式中，所述步骤a)是将植物、植物种子、植物细胞、组织或器官与携带含有编码EMB227 9蛋白的多核苷酸的农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)接触，从而使编码EMB2279蛋白的多核苷酸转入植物细胞，并整合到植物细胞的染色体上。
[0022]在优选的实施方式中，所述方法用于调节植物叶片的颜色变化。
[0023]在第三方面，本发明提供EMB2279基因或其蛋白在筛选植物叶绿体成熟促进剂或拮抗剂中的应用。
[0024]在第四方面，本发明提供筛选植物叶绿体成熟促进剂或拮抗剂的方法，所述方法包括以下步骤:
[0025]a)将待测物质给予某植物；
[0026]b)检测该植物中EMB2279基因或其蛋白的活性或表达情况；
[0027]如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表达上调，则所述待测物质是叶绿体成熟促进剂；
[0028]如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表达下调，则所述待测物质是叶绿体成熟拮抗剂。
[0029]在第五方面，本发明提供一种植物细胞，所述植物细胞中EMB2799蛋白的编码基因失活。
[0030]在优选的实施方式中，通过基因剔除、基因中断或基因插入造成EMB2799基因失活。
[0031]在另一优选的实施方式中，所述的失活还包括EMB2799基因不表达，或表达没有活性的EMB2799蛋白。
[0032]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1显示了野生型拟南芥(WT)和突变型拟南芥(130)的表型、130图位克隆结果、误剪切产物、130T-DNA插入突变体emb2279-l表型以及emb2279_l与130等位测试结果。
[0034]图2显示了在突变型拟南芥中转化野生型的EMB2279基因后获得的转基因拟南芥(35S:EMB2279/130)，在野生型拟南芥中转入干扰野生型拟南芥中EMB2279基因表达的干扰分子后获得的转基因拟南芥(Am1-EMB2279/Col)的表型。
[0035]图3显示了拟南芥AtEMB2279_GFP融合蛋白定位于叶绿体中。
[0036]图4显示了野生型拟南芥以及AtEMB2279功能缺失的突变型拟南芥的叶绿体超微结构。
[0037]图5显示了野生型拟南芥以及AtEMB2279功能缺失的突变型拟南芥光和特性的比较。
[0038]图6显示了拟南芥EMB2279的靶标。
[0039]图7显示了在突变型拟南芥中转化EMB2279-GFP (35S:EMB2279_GFP/130)以及EMB2279-FLAG (35S:EMB2279_FLAG/130)后获得的转基因拟南芥的表型。
【具体实施方式】
[0040]发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现EMB2279基因与植物的叶片转绿过程以及叶绿体的成熟相关，进而发现EMB2279蛋白是定位于叶绿体中的特异性加工叶绿体基因表达的调控因子，利用EMB2279基因可调节植物叶片颜色性状。在此基础上完成了本发明。`
[0041]植物
[0042]本文所用的术语“植物”是指可以借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质等来维系生存，并通常不发生移动的生物。在具体的实施方式中，本文所述的“植物”通常包括粮食作物和经济作物。所述粮食作物指以收获成熟果实为目的，经去壳、碾磨等加工程序而成为人类基本食粮的一类作物，例如谷类作物、薯类作物和豆类作物。而所述经济作物，又称技术作物、工业原料作物，其指具有某种特定经济用途的农作物，包括蔬菜、瓜果、花卉等园艺作物。
[0043]在优选的实施方式中，本文所述的“植物”包括但不限于:十字花科、豆科、脂麻科、菊科、藜科、山茶科、菌草科、梧桐科、爺科、五加科、多孔菌科、百合科、壳斗科、棕榈科、龙舌兰科。
[0044]在进一步优选的实施方式中，本文所述的“植物”包括但不限于:拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小麦、水稻、玉米、燕麦、黑麦、大麦、粟、高粱、青稞、棉花、麻类、花生、油菜、芝麻、大豆、向日葵、甜菜、甘蔗、茶叶、咖啡豆、可可、烟草、人参、灵芝、贝母、橡月父、挪子、油掠和剑麻，等等。
[0045]鉴于本发明的教导，本领域技术人员应该明白，本文所述的植物是其中的EMB2279基因或其蛋白的表达或活性得到抑制或增强的植物。本领域技术人员还应明白，除了成体植物本身，本文所述的植物还包括植物种子、植物细胞、植物组织或器官。
[0046]在具体的实施方式中，本发明的植物包括:转入了 EMB2279基因或其同源基因的转基因植物；或者EMB2279蛋白表达量降低(包括低表达或不表达)或表达无活性EMB2279蛋白的植物，等等。
[0047]EMB2279基因及其蛋白
[0048]在本发明中，术语“EMB2279蛋白”指具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。然而，鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员还应明白该术语包括EMB2279蛋白的变异形式，所述变异形式具有与EMB2279蛋白相同或相似的功能，但其氨基酸序列与SEQID N0:2所示氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于):一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1_8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的标签通常不会改变所得蛋白质的功能。
[0049]多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与EMB2279蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗EMB2279蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含EMB2279蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 EMB2279蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有EMB2279蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
[0050]发明还提供EMB2279蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然EMB2279蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
[0051]修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
[0052]在本发明中，“ΕΜΒ2279蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID Ν0:2所示氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
[0053]因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体。
[0054]
【权利要求】
1.EMB2279基因或其蛋白在调控植物叶绿体成熟中的应用。
2.一种调控植物叶绿体成熟的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: a)将促进或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达的物质给予植物、植物种子、植物细胞、组织或器官；和 b)培养步骤a)获得的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤a)是将编码EMB2279蛋白的多核苷酸转入植物、植物种子、植物细胞、组织或器官，获得转化入编码EMB2279蛋白的多核苷酸的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤a)是将植物、植物种子、植物细胞、组织或器官与携带含有编码EMB2279蛋白的多核苷酸的农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)接触，从而使编码EMB2279蛋白的多核苷酸转入植物细胞，并整合到植物细胞的染色体上。
5.EMB2279基因或其蛋白在筛选植物叶绿体成熟促进剂或拮抗剂中的应用。
6.一种筛选植物叶绿体成熟促进剂或拮抗剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: a)将待测物质给予某植物； b)检测该植物中EMB2279基因或其蛋白的活性或表达情况； 如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表达上调，则所述待测物质是叶绿`体成熟促进剂； 如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表达下调，则所述待测物质是叶绿体成熟拮抗剂。
7.一种植物细胞，其特征在于，所述植物细胞中EMB2799蛋白的编码基因失活。
【文档编号】A01H5/00GK103865936SQ201210536969
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月12日 优先权日:2012年12月12日
【发明者】黄继荣, 黄伟华, 吴文娟 申请人:中国科学院上海生命科学研究院