本发明涉及植物培养技术领域，尤其涉及一种植物叶片离体培养保存方法及其应用。
背景技术：
植物叶片离体保存可为领域科学研究提供鲜活的研究样品，常用于植物叶片的生理测定、遗传测定以及病理学研究。
杨树种类繁多，适应性强，生长快，是世界各国优选的用材树种和能源、木本饲料树种。杨树的引种、杂交和推广栽培是我国林业建设的重要内容之一。野外样本的采集，是丰富杨树品种、科学研究的必要环节；传统的野外采集因时间、气温等限制，需要将样本置冰壶等低温设备中带回，具有携带不方便、成本高、设备空间大、样本存活时间短等缺点。
在杨树的生理测定、遗传测定、以及病理学研究中，采集杨树叶片和进行室内研究也面临同样的问题；为此g.p.clinton等(1924)发明了叶盘法，用打孔器打取叶饼，50％的酒精表面消毒后漂洗2-3次，再置于1-1.5％的固体琼脂培养基上面，密封培养皿后光照保存，该方法在进行生理、病理研究时具有接种菌种纯度高、接种密度定量化、温度及光照等实验条件易控制、统计方便、易重复、与田间调查一致性好等优点，但叶片损失大、自然坏死率高、容易被污染、叶盘寿命短、操作不方便等缺点。
随后，littlefieldl.j.(1981)、hitoshinakamura(1998)等先后对该方法进行了改进，国内学者胡景江(2000)、田呈明(2002)、杜林(2005)等也先后对该方法进行了改进，但坏死和污染依然是研究中面临的严重问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明实施例提供了一种植物叶片离体培养保存方法及其应用，主要目的是解决离体叶片培养时叶片损失大、自然坏死率高以及生命维持时间短的技术问题。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种植物叶片离体培养保存方法，所述方法包括如下步骤：选取整叶并留取叶柄作为预培养叶；
在玻璃皿底部的内表面上铺设培养纸，在所述培养纸上倒入培养液；
将所述预培养叶的正面与含有所述培养液的培养纸表面相对紧密放置，使所述预培养叶的叶柄部分紧贴于所述培养纸以吸收所述培养纸中的所述培养液；
用保鲜膜密封所述玻璃皿形成密封玻璃皿，将所述密封玻璃皿置于培养室中进行培养；其中，所述培养室的恒温温度为25℃-28℃，每10h-14h交替选用黑暗或光照环境培养，所述密封玻璃皿内的所述预培养叶的生命存活时间为25天-100天。
作为优选，所述植物叶片为杨树叶片；留取的叶柄长度为2cm-3cm，留取叶柄的目的是帮助叶片进行水份代谢以维持叶片生命力；所述杨树优选为青杨、黑杨及其杂交杨树叶片。
作为优选，所述培养纸的面积为所述玻璃皿底部的内表面面积的三分之一至二分之一，目的是使玻璃皿中的叶片正面能见到光；所述培养纸可以延伸至所述玻璃皿的侧壁。
作为优选，所述培养纸为中性滤纸、普通家用卫生纸或普通报纸；培养皿为普通的玻璃培养皿或一次性培养皿，保鲜膜或封口膜均可用作培养皿侧壁的密封材料。
作为优选，所述培养液为赤霉素水溶液、普通自来水或无菌水；向所述培养纸上倒入所述培养液是指所述培养纸被所述培养液全部浸湿而无多余液体流出，即所述培养纸吸收所述培养液后基本达到饱和状态以维持所述玻璃皿内rh为100％。
作为优选，所述赤霉素水溶液的体积浓度为1-10‰克/升。
作为优选，所述光照环境是采用灯光照明，所述灯光照明是采用5-8根功率为15瓦的led灯管；所述灯管品牌为欧普灯管。
作为优选，所述密封玻璃皿内的相对湿度为100％以使叶片维持生命力，气孔张开，有效进行光合作用；所述密封玻璃皿内的所述预培养叶的生命存活时间为40天-60天。
作为优选，所述相对放置指将所述预培养叶倒扣在所述培养纸上，所述预培养叶的正面是指本领域技术人员一致认同的叶片的一面，即颜色光亮鲜艳的一面，与叶片背面相对；将所述叶片倒扣于所述培养纸上后，最好用镊子小心调整叶柄高度以使所述叶柄和滤纸充分接触。
另一方面，本发明实施例提供了上述培养保存方法在植物种质保存、植物遗传测定、植物生理活性测定以及致病性测定中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明针对叶盘法培养保存植物叶片出现的自然坏死率高、叶片损失大以及叶片生命维持时间短的技术问题，采用了将留有叶柄的整片叶子放于封闭的玻璃皿中，该玻璃皿底部铺设有培养纸，该培养纸中含有培养液，该叶柄可紧密接触培养纸，以及将上述封闭的玻璃皿放入25℃-28℃恒温环境和每10h-14h交替选用黑暗或光照环境进行培养的技术手段，达到了经过培养保存的叶片完整、叶片无污染、生命可维持25天-100天并且操作简单快速的技术目的，为植物种质保存、植物遗传测定、植物生理活性测定以及致病性测定提供了较好保存方法。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
实施例1
选取69杨任意叶龄健康的整片幼叶，留存2-3cm长的叶柄，准备干净的玻璃培养皿(φ＝90)、干净的中性滤纸，剪取玻璃培养皿面积1/2的中性滤纸作为培养纸，将其铺设于培养皿底部，上述中性滤纸可以沿皿壁突出，配置特定质量比的赤霉素水溶液(ga3水溶液)，量取3ml上述赤霉素水溶液并将其倒入上述中性滤纸，并使上述中性滤纸完全湿润而无多余液体流出；
将上述预培养叶倒扣于上述中性滤纸表面，使预培养叶片基部(即有叶柄的部分)紧密贴于滤纸上，预培养叶的其余部分可以在中性滤纸上，用镊子小心调整叶柄高度使叶柄和中性滤纸充分接触；用保鲜膜将上述玻璃培养皿密封，带回实验室备用；
将上述玻璃培养皿置恒温26℃，每12小时交替使用黑暗或光照环境进行培养，60天后，上述69杨叶片仍然鲜绿并可在叶柄处萌发出完整的根系，90天后叶片仍具有较强的生命力。
实施例2
选取太白杨6-10天的整叶，留存2-3cm长的叶柄，准备干净的玻璃培养皿(φ＝90)、干净的中性滤纸，剪取玻璃培养皿面积1/2的中性滤纸作为培养纸，将其铺设于培养皿底部，上述中性滤纸可以沿皿壁突出，配置浓度为10‰克/升的赤霉素水溶液(ga3水溶液)，量取3ml上述赤霉素水溶液并将其倒入上述中性滤纸，并使上述中性滤纸完全湿润而无多余液体流出；设置两个处理组，分别命名处理组1，处理组2；每个处理组处理4片叶子，共8个叶片。
采用液氮对上述太白杨离体叶片迅速研磨后，于-20℃保存备用，采用95％乙醇提取法(王元军2010)测定上述液氮研磨保存的太白杨离体叶片的叶绿素含量，制备粗酶液并将其置于4℃保存；
对上述粗酶液进行生理指标测定(hodgesetal.1999；郝再彬2006)：采用考马斯亮蓝g-250法测定上述粗酶液的可溶性蛋白质含量，采用氮蓝四唑(nbt)光还原法测定上述粗酶液的超氧化物歧化酶(sod)活性，采用愈创木酚法测定上述过氧化物酶(pod)活性，测定结果如表1所示，由测定结果可知，上述太白杨的离体叶片可维持各生理指标基本一致。
表1.太白杨离体叶片培养生理指标差异
实施例3
选取太白杨5-10天的健康的5组整片叶，留存2-3cm长的叶柄，准备干净的玻璃培养皿(φ＝90)、干净的中性滤纸，剪取玻璃培养皿面积1/2的中性滤纸作为培养纸，将其铺设于培养皿底部，上述中性滤纸可以沿皿壁突出，配置浓度为10‰克/升的赤霉素水溶液(ga3水溶液)，量取3ml上述赤霉素水溶液并将其倒入上述中性滤纸，并使上述中性滤纸完全湿润而无多余液体流出；
将上述预培养叶倒扣于上述中性滤纸表面，使预培养叶片基部(即有叶柄的部分)紧密贴于滤纸上，用镊子小心调整叶柄高度使叶柄和中性滤纸充分接触；用保鲜膜将上述玻璃培养皿密封，带回实验室备用；
将松杨栅锈菌(melampsoralarici-populinakleb.)夏孢子制成1×105的无菌水悬液，用喷壶小心的将悬液喷于太白杨叶背使液体不流动；
用保鲜膜密封培养皿，于26℃恒温、12小时黑暗/光照交替培养；观察和记录潜育期、夏孢子繁殖情况；结果表明，该方法中的5组培养叶片，均获得一致实验结果，潜育期6天，夏孢子堆产量多而大，无杂菌污染，20天内可连续收获夏孢子，叶片无明显死亡现象。
实施例4
本实施例4与实施例3的不同之处在于，培养纸采用普通报纸，40天后太白杨离体叶片仍能产生夏孢子堆，但叶肉组织已开始坏死。
由以上实施例1实施例4的测试结果可知，采用本发明离体培养叶片的方法可维持叶片生命力25天-100天；采用本发明方法培养的叶片完整、无污染，叶片的各项生理指标基本稳定；本发明方法操作简单快速；本发明方法为植物种质保存、植物遗传测定、植物生理活性测定以及致病性测定提供了较好保存方法。
本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。