专利名称：饲料型四倍体刺槐叶片总rna的提取方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学技术领域，即一种饲料型四倍体刺槐叶片总RNA的提取方法。
背景技术：
刺槐属豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Papilionaceae)植物，其叶片富含粗蛋白、糖、矿物质和维生素，是一种开发前景可观的新型饲料，尤其是四倍体刺槐的叶片其蛋白和糖的含量更为丰富，深入研究饲料型四倍体刺槐的生物学特性，对于开发优质饲料资源，提升饲养业水平，具有重要的意义。可是，由于饲料型四倍体刺槐叶片中富含大量的蛋白质和多糖，使其总RNA的提取十分困难，限制了饲料型四倍体刺槐分子生物学层面的研究，使得四倍体刺槐的选育和开发利用受到局限。RNA(植物总核糖核酸)的提取技术是一项植物分子生物学的基本实验技术之一， 也是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。只有获得纯度高、完整性好的高质量总 RNA，才能用于mRNA纯化、Northern杂交、构建cDNA文库、通过RT-PCR分离基因以及进行蛋白质体外翻译等分子生物学实验操作。常用的植物组织总RNA提取方法有异硫氰酸胍法、SDS法、苯酚法、CTAB法、热硼酸法、Trizol试剂盒法等。这些方法所用的核心试剂分别为异硫氰酸胍、SDS、CTAB和硼酸。 异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，作为强变性剂使核酸一蛋白结构发生变化，并有效解离核蛋白与核酸的复合体，最终释放出核酸。SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子表面活性剂或离子去污剂，能从低离子强度溶液中沉淀核酸以及酸性多聚糖。CTAB(十六烷基三甲基氯化铵)作为阳离子表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使RNA游离出来。硼酸缓冲体系可将蛋白酶K消化蛋白和LiCl选择性沉淀RNA等步骤偶联在一起。植物组织中的蛋白质和多糖的大量存在，对RNA的纯度和得率具有重要的影响， 四倍体刺槐尤其如此。实验表明，采用常规设备和普通化学试剂，难以有效地去除或抑制刺槐叶片破碎细胞中的蛋白质等物质的干扰，无法提取高质量的RNA。采用高端设备和进口材料，虽然可以获得RNA，但仍存在着过程复杂，成本高，产品不稳定，容易降解的问题。因此， 从富含粗蛋白和多糖的刺槐叶片中抽提高质量RNA，一直是业内公认的难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能从富含粗蛋白和多糖的饲料型四倍体刺槐叶片中提取和纯化总RNA，且过程简单、操作方便、成本低廉、结果稳定的方法。上述目的是由以下技术方案实现的一种饲料型四倍体刺槐叶片总RNA的提取方法，其特点是将四倍体刺槐叶片装入离心管研磨成粉末，加入冰浴缓冲液和巯基乙醇，离心，弃去上清，向离心管中加入CTAB提取液和β-巯基乙醇混勻，离心，取上清液， 加水饱和酚和氯仿，混勻，离心，吸取上清液，加入无水乙醇和醋酸钾溶液混勻，冰浴静置后离心，弃去上清液，用70 %乙醇清洗后进行离心，弃掉上清液，气干，用适量DEPC处理过的ddH20彻底溶解RNA沉淀。所说的饲料型刺槐叶片总RNA的提取方法，包括以下具体步骤(1)称取0. 3g植物叶片直接放入1. 5mL的离心管中，并迅速放入液氮后，用更小的离心管将叶片研磨成粉末，加入700 μ 1冰浴缓冲液，60 μ 1 β-巯基乙醇，用旋涡混合器振荡2-;3min混勻，在冰上放置IOmin后于4°C、12000g，离心lOmin。(2)弃去上清，向离心管中加入700 μ 1 CTAB提取液，50 μ 1 β-巯基乙醇，剧烈振荡2-;3min混勻。(3)将离心管置于温度为65°C的水浴7-9min，其间摇动几次。(4)将离心管从水中取出后迅速置于冰上，加入体积比为1 1的水饱和酚与氯仿共700 μ 1，剧烈振荡2-3min混勻后于4°C，12000g，离心IOmin0(5)取上清于另一新的离心管中，加入1/2体积的无水乙醇和1体积的5mol/L醋酸钾(pH 5. 8)，缓慢摇动混勻，在冰上放置IOmin后于4°C，12000g,离心IOmin0(6)弃去上清，用75%乙醇清洗沉淀，缓慢混勻，4°C，12000g，离心5min。(7)弃去上清，瞬间离心彻底弃干，在通风橱中气干5min，用DEPC处理过的ddH20 彻底溶解RNA沉淀。所说的冰浴缓冲液是由100mmol/L 的 iTris-HCl (pH，8. 0)、25mmol/L 的 EDTA(pH， 8. 0)、2. Omol/L 的 NaCl 组成。所说的CTAB提取液中加入了皂土。所说的CTAB 提取液是由 2% 的 CTAB、0. 8% 的皂土、100mmol/L 的 Tris-HCl (pH， 8. 0)、25mmol/L 的 EDTA(pH, 8. 0),1. 4mol/L 的 NaClU % 的聚乙烯聚吡咯烷酮和 0. 1 % 的 DEPC组成。所说的75%乙醇是由7. 5份无水乙醇和2. 5份DEPC处理过的ddH20配制，DEPC处理过的ddH20是由0. 1份DEPC加入99. 9份ddH20中漩涡混勻再经高温高压灭菌的纯水。本发明的有益效果是叶片直接在离心管里研磨，以减少操作时间和材料用量，利用加入皂土的提取液可更好的去除大量蛋白对RNA提取的干扰；利用氯仿/异戊醇只抽提一次，节省操作时间和费用；加入高浓度和大体积的醋酸钾以去除多糖，从而获得高纯度、 高产量且完整稳定的RNA，可满足反转录、基因克隆、转录组分析以及荧光定量PCR等分子生物学分析，且具有操作简便、成功率高、适用范围广、无降解、普通设备和国产化学试剂即可满足要求等特点，为深入进行饲料型刺槐以及同类植物的分子生物学研究提供了条件。
图1未加入皂土的CTAB法提取的四倍体刺槐叶片的总RNA ；图2利用Trizol提取的四倍体刺槐叶片的总RNA ；图3SDS法提取的四倍体刺槐叶片的总RNA ；图4SDS-CTAB法提取的四倍体刺槐叶片的总RNA ；图5不同浓度皂土提取的四倍体刺槐叶片的总RNA。
具体实施例方式本发明总的构思是以普通设备和国产化学试剂为主，以消除蛋白和多糖的干扰
4为目标，采用了在提取液中加入皂土、沉淀前加入大量醋酸钾等去除过多蛋白质及多糖的关键技术，进而得到完整稳定的RNA产品。具体做法是将刺槐叶片直接在离心管中研磨成粉末，加冰浴缓冲液和β-巯基乙醇，离心；弃去上清液，加提取缓冲液和β-巯基乙醇，振荡混勻，热水浴处理；加水饱和酚和氯仿，振荡混勻，离心；吸取上清液加入无水乙醇和醋酸钾溶液混勻、冰浴静置后再离心，弃去上清液，用70%乙醇清洗后进行离心，弃掉上清液， 气干，用适量DEPC处理过的ddH20彻底溶解RNA沉淀。围绕上述技术路线的实施方式是很多的，为了说明问题，下面仅介绍一个实施例制备ddH20 由0. 1份DEPC加入99. 9份ddH20中漩涡混勻再经高温高压灭菌即得。制备75%的乙醇7. 5份无水乙醇和2. 5份DEPC处理过的ddH20配成。制备冰浴缓冲液100mmol/L的 Tris-HCl (pH，8. 0)，25mmol/L 的 EDTA(pH，8. 0)， 2.Omol/L 的 NaCl。制备CTAB 提取液2 % 的 CTAB，0. 8 % 的皂土，IOOmmol/L 的 Tris-HCl (ρΗ，8· 0)， 25mmol/L 的 EDTA(pH, 8. 0)，1. 4mol/L 的 NaCl，1 % 的聚乙烯聚吡咯烷酮和 0. 的 DEPC0取1. 5mL的离心管，预先加入600-800 μ 1冰浴缓冲液，60 μ 1 β -巯基乙醇，在冰
上放置备用；称取0. 3g植物叶片，直接放入备用的1. 5ml离心管中，用小离心管做研磨棒将叶片研磨成粉末，与研磨后送入离心管的方法相比可节省时间约0. 5小时左右。用旋涡混合器振荡2-;3min混勻，在冰上放置IOmin后于4°C，12000g，离心lOmin，弃去上清，向离心管中加入700 μ 1 CTA β提取液，50 μ 1 β -巯基乙醇，剧烈振荡 2-3min 混勻；将离心管置于温度为65°C的水浴7-9min，其间摇动几次；将离心管从水中取出后迅速置于冰上，加入体积比为1 1的水饱和酚与氯仿共 700μ 1，剧烈振荡2-;3min混勻后于4°C，12000g，离心lOmin。取上清于另一新的离心管中， 加入1/2体积的无水乙醇和1倍体积的5mol/L醋酸钾，缓慢摇动混勻，在冰上放置IOmin 后于4°C，12000g，离心lOmin。醋酸钾的用量一般不大于1/2体积和2mol/L的，此步骤中的醋酸钾的用量超出常规用量，实验证明，常规用量难以达到去除多糖的效果。弃去上清，用75%乙醇清洗沉淀，缓慢混勻，4°C，12000g，离心5min。弃去上清，瞬间离心以达到彻底弃干的目的。在通风橱中气干5min。用DEPC处理过的ddH20彻底溶解RNA沉淀。本方法所用的实验较多，下面仅例举三个实验1.皂土浓度影响实验 皂土浓度分别以0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，得到图5所示的效果。从图5可以看出未加皂土时，虽然可以提出RNA，但是浓度较低，而加入的皂土浓度为0. 2% 和0. 4%时，提取的RNA带型拖尾，而当加入皂土浓度为0. 6%和0. 8%时，提取的RNA带型较为清晰，当皂土的浓度为1.0%时，带型又变得模糊不清。因此在本发明中采用的皂土浓度为0.6%。2.不同提取方法的电泳对比实验图1显示了未加入皂土的CTAB法提取的四倍体刺槐叶片的总RNA，采用此法提取的RNA带型模糊，较浅，得率较低，为347. 61% (见附表)；图2显示了利用Trizol法提取的四倍体刺槐叶片的总RNA，其带型不明显，而且在点样孔中存在大量蛋白，同时采用该方法的RNA得率也较低，为325. 68% (见附表)；图3显示了利用SDS法提取的四倍体刺槐叶片的总RNA，利用该法提取的RNA带型不明显，且得率较低为347. 96% ；图4显示的是利用 SDS-CTAB法提取的四倍体刺槐叶片的总RNA，利用该方法提取的RAN带型模糊，且得率较低为659. M%，且在点样孔中存在大量蛋白；图5是利用添加不同浓度皂土后所提取四倍体刺槐叶片的总的RNA。3.不同提取方法的得率对比实验附表说明不同方法所提取的RNA纯度和得率(表格中的数据为三次生物学重复的平均值)
权利要求
1.一种饲料型四倍体刺槐叶片总RNA的提取方法，其特征在于将四倍体刺槐叶片装入离心管研磨成粉末，加入冰浴缓冲液和β-巯基乙醇，离心，弃去上清，向离心管中加入 CTAB提取液和β -巯基乙醇混勻，离心，取上清液，加水饱和酚和氯仿，混勻，离心，吸取上清液，加入无水乙醇和醋酸钾溶液混勻，冰浴静置后离心，弃去上清液，用70%乙醇清洗后进行离心，弃掉上清液，气干，用适量DEPC处理过的ddH20彻底溶解RNA沉淀。
2.根据权利要求1的饲料型四倍体刺槐叶片总RNA的提取方法，其特征在于所说的提取方法包括以下具体步骤(1)称取0.3g植物叶片直接放入1. 5mL的离心管中，并迅速放入液氮后，研磨成粉末， 加入700 μ 1冰浴缓冲液，60 μ 1 β -巯基乙醇，用旋涡混合器振荡2-aiiin混勻，在冰上放置 IOmin 后于 4°C，12000g,离心 IOmin0(2)弃去上清，向离心管中加入700μ 1 CTAB提取液，50μ1 β-巯基乙醇，剧烈振荡 2-3min 混勻。(3)将离心管置于温度为65°C的水浴7-9min，其间摇动几次。(4)将离心管从水中取出后迅速置于冰上，加入体积比为1 1的水饱和酚与氯仿共 700 μ 1，剧烈振荡2-3min混勻后于4°C，12000g，离心IOmin0(5)取上清于另一新的离心管中，加入1/2体积的无水乙醇和1体积的5mol/L醋酸钾 (pH 5. 8)，缓慢摇动混勻，在冰上放置IOmin后于4°C，12000g,离心IOmin0(6)弃去上清，用70%乙醇清洗沉淀，缓慢混勻，4°C，12000g，离心5min。(7)弃去上清，瞬间离心气干，在通风橱中气干5min，用DEPC处理过的ddH20彻底溶解 RNA沉淀。
3.根据权利要求1或2所述的从饲料型刺槐叶片中提取总RNA的方法，其特征在于所说的冰浴缓冲液是由 100mmol/L 的 Tris-HCl (pH，8. 0)、25mmol/L 的EDTA(pH，8. 0)、2. Omo 1/ L的NaCl组成。
4.根据权利要求1或2所述的从饲料型刺槐叶片中提取总RNA的方法，其特征在于 所说的CTAB提取液中加入了皂土。
5.根据权利要求1或2或4所述的从饲料型刺槐叶片中提取总RNA的法，其特征在于所说的 CTAB 提取液是由 2 % 的 CTAB、0. 8 % 的皂土、100mmol/L 的 Tris-HCl (pH，8. 0)、 25mmol/L 的 EDTA (pH，8. 0)、1. 4mol/L 的 NaClU % 的聚乙烯聚吡咯烷酮和 0. 1 % 的 DEPC 组成。
6.根据权利要求2所述的从饲料型刺槐叶片中提取总RNA的方法，其特征在于所说的75%乙醇是由7. 5份无水乙醇和2. 5份DEPC处理过的ddH20配制，DEPC处理过的ddH20 是由0. 1份DEPC加入99. 9份ddH20中漩涡混勻再经高温高压灭菌的。
全文摘要
本发明涉及植物分子生物学领域，即一种饲料型四倍体刺槐叶片总RNA的提取方法。特点是将四倍体刺槐叶片装入离心管磨细，加入冰浴缓冲液和β-巯基乙醇，离心弃上清，加入CTAB提取液和β-巯基乙醇，离心取上清液，加酚和氯仿，混匀离心取上清液，加入乙醇和醋酸钾溶液混匀，冰浴静置弃上清液，乙醇清洗后弃上清液，气干，用ddH2O溶解RNA沉淀。其有益效果是叶片直接在离心管里研磨以及利用氯仿只抽提一次，减少了操作时间和材料用量，提取液加入皂土可更好的去除蛋白的干扰，大量的醋酸钾以去除多糖，从而获得高纯度、高产量且完整稳定的RNA，具有操作简便、成本低、普通设备和国产化学试剂即可满足要求等特点，为深入进行饲料型刺槐及同类植物的分子生物学研究提供了条件。
文档编号C12N15/10GK102424821SQ201110434648
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者刘磊, 孟凡娟, 黄凤兰 申请人:东北林业大学