专利名称：一种离体叶片鉴定棉花黄萎病的方法
技术领域：
本发明属于棉花抗病育种技术领域，涉及一种离体叶片鉴定法鉴定植物病害技术领域。本发明具体涉及一种离体叶片鉴定棉花黄萎病的方法，为作物抗病育种提供抗性材料的早期快速鉴定。
背景技术：
棉花黄萎病是棉花最重要的病害之一，危害严重，而且棉花黄萎病菌致病力变异性强，在与寄主协同进化的过程中，由于病菌异核现象和生态环境差异的影响，常出现生理分化，出现新的致病类型，因此摸清我国主要植棉区棉花黄萎病的致病力分化情况，寻求一 种快速准确的棉花抗黄萎病鉴定技术是当今棉花抗病育种的迫切要求，对我国棉花的可持续发展有着重要的意义。 张兴华，田绍仁等人在棉花抗棉铃虫室内生物学测定中对棉叶活力保鲜技术进行了研究，采用透明的聚丙烯塑料盒内填聚氨酯人造海绵加水做培养基，不仅保鲜而且能保持棉叶的生命活力，而且保证了棉铃虫抗性测定的准确性(马丽华，李春花，棉花抗棉铃虫性室内生物测定新方法，中国棉花，实用技术，1998,25(7) 27-36)受此启发，以棉叶保鲜技术为基础对棉花抗黄萎病鉴定技术进行了探索，以试探是否可以通过离体叶片接菌的方式进行抗病鉴定。笔者称之为离体叶片鉴定法，即在大田中，取棉株果枝上的成熟叶片，经消毒、清洗以及干燥后，叶柄蘸菌，在保鲜盒中离体培养并观察棉苗发病情况的一种棉花抗黄萎病鉴定方法。通过此方法，不仅可以同时测定多个菌系对同一单株的致病力情况，而且能够进行抗性遗传的相关研究，在棉花育种单位具有应用推广价值。因此，一旦此方法成熟，将作为一种快速、准确的鉴定技术应用于棉花黄萎病鉴定中。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种快速、简便和灵敏度高的离体叶片鉴定棉花黄萎病的方法。本发明的技术方案如下一种离体叶片鉴定棉花黄萎病的方法，包括如下步骤I)将冰箱中试管保存的保藏号为CCTCC NO M2011095的大丽轮枝菌6SY2-37转移至盛有PDA培养基的培养皿中，之后将培养皿放在恒温箱中进行活化，活化温度为25°C，活化时间为10-15d，取一直径约4mm的菌块放入盛有50ml Czapek’ s培养基的三角瓶中，于25°C下振荡培养5-6d;2)将步骤I)的病菌培养物用双层纱布过滤，在显微镜下用血球计数板统计孢子数，用无菌水将孢子调至5 X IO6个/ml的孢子悬浮液；3)透明的聚乙烯保鲜盒经浓度75%的酒精消毒后，用无菌水冲洗2次，然后放入已裁剪好的海绵加水作为培养基；4)从大田取棉株果枝上的成熟叶片作为外植体，在超净工作台上用浓度75%的酒精消毒，无菌水冲洗3-4次，然后放在灭菌的滤纸上，待水分被吸干后，叶柄蘸菌，浸入保藏号为CCTCC NO M2011095的大丽轮枝菌6SY2-37，菌液浓度为5 X IO6个/ml的大丽轮枝菌6SY2-37孢子悬浮液中l_2s后立即取出，直立插入海绵切口处，叶间距为2-3cm，最后放置在25°C条件下的温室中进行离体培养，IOd后观察棉花叶片发病情况。其中步骤I)中所述的 Czapek’ s 培养基配方为FeS040. 02g/L，NaN032g/L，MgS04lg/L，KCllg/L，KH2P04lg/L，蔗糖 30g/L ；pH6. 0 ;补充蒸馏水至 1L。申请人:从湖北省沙洋县感染棉花黄萎病的棉株上分离得到一株专用于离体叶片鉴定棉花黄萎病的大丽轮枝菌6SY2-37 (Verticillium dahliae 6SY2-37)，于2011年3月25日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO M2011095o本发明的其中一个优点是利用本发明的保鲜盒中进行叶片离体培养时，盒底部的海绵吸足了水分，为叶片根系的正常发育提供了充足的水分，也为叶片发病提供了适宜的湿度。另外，保鲜盒为透明的聚乙烯盒，叶片在其内部可以得到充足的光照，保证了叶片能正常进行光合作用，进而产生养分为棉叶自身提供生命动力，所以叶片能长时间保鲜，保鲜时间可达到30d以上，保鲜时间超过了抗病鉴定所需时间(一般15-20d)，为离体叶片抗病鉴定奠定了基础，因此可用此法进行抗病材料的早期快速鉴定。本发明的另一个优点是，一株棉株可以同时接种不同的菌株，如可同时接种不同致病力、不同菌系的菌株，来研究棉花品种对不同黄萎病菌的抗性，进而研究生理小种分化，可实现育种材料鉴定的灵活性。另外，离体叶片鉴定法无需准备大量的灭菌土和塑料钵，可实现无土化，简单易操作，较适合大批量抗病材料的鉴定与筛选。
图I.离体叶片病情分级标准。叶片发病症状及病情分级标准见图I :叶片接菌IOd后，开始陆续出现黄萎病的症状，15-20d普遍发病。一般是叶片的边缘叶肉先开始变黄，之后病症慢慢扩展整个叶片，但也有部分叶片在边缘部位和内部同时出现黄色斑点状，之后变成焦枯状。图2.离体叶片根系发育情况。图2显示空白对照和其它接菌处理的叶片，在7d后陆续萌发生根。30d后，空白对照的叶片发育正常，根系发达，最长的根长可达14cm。接菌处理的叶片也萌发发达的根系，但与空白对照相比相对较短，最短根长为2cm。调查结果显示，孢子浓度越大，叶片萌发生根的速度越慢，这可能与孢子浓度有关，浓度越大，毒素的浓度越大，毒素对叶柄的愈伤组织有毒副作用，抑制其萌发生根。图3.离体叶片病原菌分离结果。其中图3A :未发病叶片对照；图3B :发病叶片分离出的菌的菌落形态；图3C :菌丝形态；图3D :黑色的微菌核；图3E :分生孢子形态)分别取发病和未发病的叶片进行病原菌的分离，分离结果见图3。图3A为未发病叶片对照，没有分离出任何菌(见图3A)。图3B显示，所分离出的菌落形态为中间呈黑色，外围是白色的菌丝，显微镜下观察菌丝呈轮枝状(见图3C)，菌丝部分膨大产生黑色的微菌核(见图3D)，分生孢子呈卵圆形(见图3E)。由此可判定该菌为大丽轮枝菌，即分离出的菌为所接的黄萎病菌，进而证明了叶片所表现的症状为黄萎病的症状。图4.不冋品种抗性鉴定效果。图中图左两列为感病品种鄂棉24，图右两列为抗病品种银瑞361。
具体实施例方式实施例I一、试验材料、海绵规格为27X 18X Icm(商品)；保鲜盒为普通聚乙稀塑料盒(商品)规格为30 X 20 X 10cm。鄂棉24(湖北省农作物品种审定委员会审定的常规棉花品种，由湖北省黄冈市农科院选育并提供种子，该品种已经公开推广，参见网址http: //baike. baidu. com/view/2089471, htm),银瑞361 (抗虫棉常规品种，山东省德州市银瑞棉花研究所和中国农业科学院生物技术研究所联合选育，在中国推广应用，该品种的种子由中国农科院棉花研究所提供，未公开推广的品种。见网址http://www. foodsl. com/content/409310/)。其中鄂棉24在生产上表现感病，银瑞361在生产上具有一定抗病性。所用菌种为为本发明人自己分离筛选的鉴定棉花黄萎病的专用菌株大丽轮枝菌6SY2-37(保藏号为CCTCC NO M2011095)由华中农业大学植物病理实验室提供的强致病力的落叶型菌株。筛选方法2007年10月从湖北省沙洋县鄂杂棉10号采集的棉花黄萎病病株，采用升汞和酒精表面消毒法进行分离。将病株枝条洗净、切段，在超净工作台中用无菌水清洗2-3次,再用70%的酒精消毒30s，无菌水清洗3-5次。然后用0. I %的升汞消毒2min，用无菌水清洗3-5次，用剪刀剪成小块放入PDA培养基中，25°C恒温培养3_4d，进行病原菌鉴定、菌种保存备用。采用稀释平板法对菌株进行单孢分离。在培养15d的PDA平板上，用2_3mL的无菌水洗孢子，制成孢子悬浮液，经5层擦镜纸过滤菌丝后，在显微镜下用血球记数板观察，将浓度稀释为4X IO6个/mL，取0. Iml置入水琼胶培养基平板上，均匀散开，培养皿底面划成小方格，置24-25°C温箱中12-24小时后镜检，选取方格内只有单个孢子的做好标记，然后按无菌操作挑取方格内培养基，移入PDA平板上，长出的菌落即为单孢菌系，移入试管斜面，保存备用。根据病原菌菌落的培养性状，形态特征，以及大丽轮枝菌分生孢子梗轮支状、每轮有3 4分枝，含黑色的微菌核等特征，对分离的菌株进行鉴定。菌种鉴定工作参照魏景超《真菌鉴定手册》上海科学技术出版社，1979版介绍的方法。大丽轮枝菌6SY2-37的生物学特征分生孢子长卵圆形，单细胞极少分隔，大小为2. 3 9. IX I. 5 3. Oum0分生孢子梗轮枝状，每轮有3 4分枝，全长110 130um，分枝大小13. 8 21. 4 X 2. 3 2. 7um，梗基部无色透明，菌落生长无色菌丝体，生长较长时间菌丝变褐色，有隔膜直径2 4um。菌丝体常呈膨胀状，可由单根菌丝或数根菌丝芽殖形成菌核。不同地区棉花大丽轮枝菌微菌核形成的数量、大小和性状有明显的差异。将棉花大丽轮枝菌6SY2-37在PDA培养基上活化，25°C黑暗生长7-10d后。取直径约4mm的菌块放入盛有50ml Czapek’ s培养基的三角瓶中，25°C下振荡培养5_6d。然后，将病菌培养物用双层纱布过滤。显微镜下用血球计数板统计孢子数，稀释并配制成所需孢子浓度。将分离得到的大丽轮枝菌6SY2-37，于2011年3月25日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO :M2011095。离体叶片鉴定棉花黄萎病方法的试验设计①载体的准备取洁净的规格为27 X 18 X Icm的海绵，每块海绵用剪刀剪出20个4X Icm的缝口，每排4个，共5排，并让海绵充分吸水(灭菌后的自来水)，放入用75%酒精消过毒的30 X 20 X IOcm的保鲜盒内备用。②试验材料的准备
大田取样，取棉株果枝上的成熟叶片(叶柄长0. 5cm)。③接菌(大丽轮枝菌6SY2-37)试验同时考虑浸菌时间和孢子浓度两因素随机区组设计。浸菌时间设3个处理l-2s ;30min和lh。孢子浓度设3个梯度5 X 106、I X IO7和2 X IO7个/ml。每个处理中，鄂棉24和银瑞361各取10片真叶。一个保鲜盒一个处理，共10个处理(含I个空白对照)浸菌时将叶柄全部浸在大丽轮枝菌6SY2-37孢子液中，之后将叶片竖直插入海绵的切口处。保鲜盒用盖子密封。放在温室中，温度设定在25°C，IOd后观察发病情况。④病情分级以发病部位面积占整个叶片面积的百分比进行病情分级，共分5个等级0、1、2、
3、4。0级未发病；1级25%以下；2级25% 50%;3级50% 75%;4级75%以上。⑤发病叶片的病菌分离验证由于叶片离体鉴定容易污染，为了验证表现病状的叶片是否由黄萎病菌引起的，取发病的叶片进行分离，看是否能分离出大丽轮枝菌。分离方法为(1)取发病的叶片，在发病部位和未发病部位的连接处，取5块8_X 4mm的叶片；(2)先用I % NaClO3消毒Imin,之后用升汞消毒10-15S，再用无菌水冲洗；(3)用灭过菌的吸水纸吸去多余的水分；(4)将叶片放入PDA培养基上。7d后观察菌落、菌丝、微菌核和孢子形态，对所分离的菌进行形态学鉴定。二、试验结果①空白对照和其它接菌处理的叶片，在7d后陆续萌发生根。孢子浓度越大，叶片萌发生根的速度越慢，这可能与孢子浓度有关，浓度越大，毒素的浓度越大，毒素对叶柄的愈伤组织有毒副作用，抑制其萌发生根。30d后，空白对照的叶片发育正常，根系发达，最长的根长可达14cm。②接菌后18d，在所设的不同处理中(空白对照除外)，对感病品种鄂棉24的病指进行方差分析。分析结果显示，同一浓度不同浸菌时间梯度之间没有显著差异，同一浸菌时间不同浓度梯度之间没有显著差异。说明在所设的9个处理中，发病情况与浸菌时间和浸菌浓度无关，故进行抗病鉴定时，可选任意处理进行鉴定。建议选用浸菌时间l_2s、浸菌浓度5X IO6个/ml这一组合。因为所用浓度低，菌量相对较少，配制方便；另外浸菌时间短，简单易操作。③适宜的调查时期为接菌后15-20d。在这个时期叶片普遍发病，抗感品种区分明显。
⑤从发病的叶片上分离得到的菌进行了形态学鉴定，其从菌落上来看，菌落中间呈现黑色(微菌核)，外围是白色的菌丝，显微镜下观察菌丝呈轮枝状，分生孢子呈卵圆形，由此可判定分离得到的菌为所接的大丽轮枝菌，进而证明了叶片所表现的症状为黄萎病的症状。本发明用SPSS16. 0对鄂棉24和银瑞361不同处理的病指进行方差分析见表I所
/Jn o表I.不同处理鄂棉24和银瑞361病指方差分析
权利要求
1.一种离体叶片鉴定棉花黄萎病的方法，其特征包括如下步骤 1)将冰箱中试管保存的保藏号为CCTCCNO :M2011095的大丽轮枝菌6SY2-37转移至盛有PDA培养基的培养皿中，之后将培养皿放在恒温箱中进行活化，活化温度为25°C，活化时间为10-15d，取一直径约4mm的菌块放入盛有50ml Czapek’ s培养基的三角瓶中，于25°C下振荡培养5-6d ； 2)将步骤I)的病菌培养物用双层纱布过滤，在 显微镜下用血球计数板统计孢子数，用无菌水将孢子调至5 X IO6个/ml的孢子悬浮液； 3)透明的聚乙烯保鲜盒经浓度75%的酒精消毒后，用无菌水冲洗2次，然后放入已裁剪好的海绵加水作为培养基； 4)从大田取棉株果枝上的成熟叶片作为外植体，在超净工作台上用浓度75%的酒精消毒，无菌水冲洗3-4次，然后放在灭菌的滤纸上，待水分被吸干后，叶柄蘸菌，浸入保藏号为CCTCC NO M2011095的菌液浓度为5 X IO6个/ml的大丽轮枝菌6SY2-37孢子悬浮液中l-2s后立即取出，直立插入海绵切口处，叶间距为2-3cm，最后放置在25°C条件下的温室中进行离体培养，IOd后观察棉花叶片发病情况。
其中 步骤 I)中所述的 Czapek，s 培养基配方为=FeSO4O. 02g/L, NaN032g/L, MgSO41g/L,KCllg/L，KH2P04lg/L，蔗糖 30g/L ；pH6. 0 ;补充蒸馏水至 1L。
2.一株专用于离体叶片鉴定棉花黄萎病的大丽轮枝菌6SY2-37，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO :M2011095。
3.权利要求2所述的菌株在离体叶片鉴定棉花黄萎病中的应用。
全文摘要
本发明属于棉花抗病育种技术领域，具体涉及一种离体叶片鉴定棉花黄萎病的方法。其步骤如下1)将保存的大丽轮枝菌6SY2-37转移至盛有PDA的培养皿中，置于25℃下活化10-15d，取菌块至Czapek’s培养基的三角瓶中，培养5-6d；2)病菌培养物过滤，调至5×106个/ml的孢子悬浮液；3)聚乙烯保鲜盒消毒，以海绵加水作培养基；4)以棉花成熟叶片作外植体，消毒，置灭菌的滤纸上，叶柄蘸菌，浸入5×106个/ml的大丽轮枝菌6SY2-37菌液1-2s后立即取出，将所述的叶片直立插入海绵切口处，叶间距为2-3cm，25℃离体培养，10d后观察棉花叶片发病情况。本发明的方法快速、灵敏度高、简单易操作，较适合大批量抗病材料的鉴定与筛选。
文档编号A01G1/00GK102726177SQ20111008315
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者史认辉, 惠慧, 郝荷荷, 郭小平 申请人:华中农业大学