专利名称：一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域的植物基因转化方法，即一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法。
背景技术：
关于蓖麻转基因方面的研究目前国内外报道极少，Sujatha M等在2005年首次报道利用农杆菌介导法对蓖麻胚轴进行遗传转化，在表达载体上构建了除草剂抗性基因bar， 以除草剂Basta为筛选剂，获得了转基因蓖麻植株。MalathiB等在2006年报道用相同的方法获得转基因植株。这种技术的缺点是所需要的时间较长。Mckeon T A等在2003年申报专利，用农杆菌侵染蓖麻的整株、芽尖和胚轴、花芽。其中整株转化是在植株长到20-25cm 高时，将其子叶和第一组真叶剪除，连根拔起，倒置到盛有农杆菌渗透液的烧杯中。该烧杯置于一个真空干燥器中，真空处理后将植株再种回花盆。处理两周后对该植株第二组真叶的叶圆片进行GUS染色检测，发现有阳性反应。芽尖和胚轴的转化是将农杆菌渗透液滴注到芽尖和胚轴表面进行转化处理。培养处理过的芽尖和胚轴再生植株而获得转基因蓖麻植株。花芽的转化主要是将蓖麻雌花花芽的尚未开放的花苞的侧面用针划出伤口，而后将农杆菌LBA4404渗透液滴注到伤口上，最后用塑料袋包住处理的花芽以保湿。这样的处理可重复进行，直到雌花开放。收集处理过的花所结的种子经筛选有可能获得转基因的蓖麻植株。这种方法简单易行，避免了组织培养的繁琐过程，但其缺点是所获得的转基因植株多为嵌合体。由此可见，蓖麻转基因的研究还很不深入，还没有建立一个高效、稳定的遗传转化体系，更没用找到一种比较成熟的蓖麻遗传转化体系的建立方法。发明内容
本发明的目的是提供一种在较短的时间内，建立高效、稳定的蓖麻遗传转化体系的方法。
上述目的是由以下技术方案实现的提供一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法，其特点是所说的方法是以农杆菌为介导载体，以蓖麻子叶节为受体，通过予培养、 农杆菌侵染、共培养、菌除、筛选和芽生根，得到具有可遗传目的基因的蓖麻植株。
所说的蓖麻子叶节的选取方法是将蓖麻种子去掉外种皮后消毒、接种，待种子萌发后，选择胚轴和子叶均为淡黄色时期的萌发种子，切取子叶节。
所说的农杆菌是LBA4404，内含pBI_l21-RTA-RTA重复表达载体，pBI-121上带有卡那霉素抗性基因。
所说的蓖麻子叶节预培养的培养基为l/8MS+ZT(8mg/L)+NAA(lmg/L) +蔗糖(20g/ L) +琼脂粉(10g/L)，预培养时间设定为2天。
所说的农杆菌侵染是用0D_为0. 5的农杆菌LBA4404，侵染预培养后的子叶节，侵染时间为20min。
所说的共培养是将用农杆菌侵染完的子叶节接种到l/8MS+ZT(8mg/L)+NAAdmg/3L) +蔗糖O0g/L) +琼脂粉(10g/L)+乙酰丁香酮(ΙΟΟμΜ/L)的培养基中进行共培养，共培养时间设为5天，在培养基上可见农杆菌单个菌斑为止。
所说的除菌是将共培养后的子叶节接种到l/8MS+ZT(8mg/L)+NAA(lmg/L) +蔗糖 O0g/L) +琼脂粉(10g/L)+2;3mg/L卡那霉素的培养基上，同时添加浓度为1. 2g/L的头孢。
所说的筛选是以浓度为23mg/L卡那霉素对除菌后的蓖麻子叶节进行培养处理， 筛选时间为30天。
所说的生根阶段培养基为1/16MS+蔗糖O0g/L)+琼脂粉(10g/L)，同时添加浓度为1. 0mg/L的NAA，当抗性芽根发育良好后进行驯化移栽。
本发明的有益效果是过程简单，参数优化，操作方便，成本低廉，能在较短的时间内完成蓖麻遗传转化体系的建立，所得到的抗性苗经PCR检测获得满意的效果，从而为简单、高效地进行蓖麻转基因研究奠定了基础。
图1是pBI-121-RTA-RTA重复表达载体图谱；
图2是蓖麻遗传体系建立流程图。
具体实施方式
本发明总的构思是针对现有技术存在的问题，改用在蓖麻转基因实验中尚未用过的蓖麻子叶节为受体，以农杆菌为介导，以卡那霉素为筛选剂，以头孢为除菌剂，通过预培养、农杆菌侵染、共培养、菌除、筛选和芽生根等过程，得到具有可遗传目的基因的蓖麻植株，特别是可用于蓖麻转基因研究的材料体系。
围绕上述构思，通过大量的实验，找到了各个步骤的具体做法。下面介绍有关的实施过程和实验方法
一、实验材料的准备
植物材料为通蓖5号，购自通辽市农科院通科种业有限公司；
农杆菌LBA4404，内含pBI_l21-RTA-RTA重复表达载体，pBI-121上带有卡那霉素抗性基因，pBI-121-RTA-RTA重复表达载体图谱见图1，由实验室保存。
LA Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker、引物、卡那霉素、利福平、硫酸链霉素等均购于TaKaRa公司；头孢为上海新先锋药业有限公司生产；玉米素(ZT)、乙酰丁香酮为进口分析纯，萘乙酸(NAA)等其他化学药品为国产的分析纯。
二、实验情况
1.蓖麻子叶节最适卡那霉素抗性浓度的筛选由于采用卡那霉素为筛选剂，首先需要掌握蓖麻子叶节自身的卡那霉素抗性指标，具体实验过程和结果如下
蓖麻种子去掉外种皮后消毒、接种。待种子萌发后，选择胚轴和子叶均为淡黄色时期的萌发种子，切取子叶节。将子叶节接种到1/8MS+ZT 8. 0mg/L+NAAl. 0mg/L+蔗糖20g/ L+琼脂粉10g/L pH值5. 8的培养基上培养。7天后，在其他成分不变的情况下，在加入卡那霉素的培养基上对子叶节进行抗性浓度的筛选，叶节处所长的芽均为白色芽所对应的卡那霉素浓度即为适宜的卡那霉素抗性浓度。筛选实验分4次进行
第一次筛选卡那霉素的浓度梯度为0、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、IOOmg/L，统计结果见表1
表 权利要求
1.一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法，其特征在于所说的方法是以农杆菌为介导载体，以蓖麻子叶节为受体，通过予培养、农杆菌侵染、共培养、菌除、筛选和芽生根，得到具有可遗传目的基因的蓖麻植株。
2.根据权利要求1所述的一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法，其特征在于所说的蓖麻子叶节的选取方法是将蓖麻种子去掉外种皮后消毒、接种，待种子萌发后， 选择胚轴和子叶均为淡黄色时期的萌发种子，切取子叶节。
3.根据权利要求1所述的一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法，其特征在于所说的农杆菌是LBA4404，内含pBI-121-RTA-RTA重复表达载体，pBI-121上带有卡那霉素抗性基因。
4.根据权利要求1所述的一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法，其特征在于所说的蓖麻子叶节预培养的培养基为l/8MS+ZT(8mg/L)+NAA(lmg/L) +蔗糖QOg/L) +琼脂粉(10g/L)，预培养时间为2天。
5.根据权利要求1所述的一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法，其特征在于所说的农杆菌侵染是用0D_为0. 5的农杆菌LBA4404，侵染预培养后的子叶节，侵染时间为20min。
6.根据权利要求1所述的一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法，其特征在于所说的共培养是将用农杆菌侵染完的子叶节接种到l/8MS+ZT(8mg/L)+NAA(lmg/L) +蔗糖O0g/L) +琼脂粉(10g/L)+乙酰丁香酮(ΙΟΟμΜ/L)的培养基中进行共培养，共培养时间为5天，在培养基上可见农杆菌单个菌斑为止。
7.根据权利要求1和3所述的一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法，其特征在于所说的除菌和筛选是将共培养后的子叶节接种到l/8MS+ZT(8mg/L)+NAA(lmg/L) +蔗糖O0g/L)+琼脂粉(10g/L)+23mg/L卡那霉素的培养基上，同时添加浓度为1. 2g/L的头孢。
8.根据权利要求1所述的一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法，其特征在于所说的筛选是以浓度为23mg/L卡那霉素对除菌后的蓖麻子叶节进行处理，筛选时间为 30天。
9.根据权利要求1所述的一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法，其特征在于所说的生根阶段培养基为1/16MS+蔗糖O0g/L)+琼脂粉(10g/L)，同时添加浓度为 1. Omg/L的NAA，当抗性芽根发育良好后进行驯化移栽。
全文摘要
本发明涉及生物工程领域的植物基因转化方法，即一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法，其特征在于所说的方法是以农杆菌为介导载体，以蓖麻子叶节为受体，通过予培养、农杆菌侵染、共培养、菌除、筛选和芽生根，得到具有可遗传目的基因的蓖麻后代。其有益效果是过程简单，参数优化，操作方便，成本低廉，能在较短的时间内完成蓖麻遗传转化体系的建立，所得到的抗性苗经PCR检测获得满意的效果，从而为简单、高效地进行蓖麻转基因研究奠定了基础。
文档编号C12N15/84GK102517327SQ20111043467
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者孟凡娟, 彭木, 李国瑞, 陈丽丽, 陈永胜, 黄凤兰 申请人:内蒙古民族大学