在植物中木质化的降低的制作方法

在植物中木质化的降低的制作方法
【专利摘要】本发明提供了含有编码羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL)的序列的多核苷酸的表达盒，其与异源启动子可操作地连接。也提供了工程改造有降低木质化的植物，以及来自如此工程改造的植物的细胞、植物部分和植物组织的方法。
【专利说明】在植物中木质化的降低
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求2013年7月13日提交的美国临时申请号61/507，484的优先权，其通过引用纳入本文。
[0003]联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明
[0004]本发明是在美国能源部授予的合同号DE-AC02-05CH11231下由政府资助完成。政府享有本发明的某些权利。
[0005]发明背景
[0006]在各种农业-工业活动中使用木质纤维素植物生物质作为可再生原料。木质素是在生物质内包壳的芳族和疏水性的支链聚合物，其在工业加工中负面影响多糖的提取和水解。工程改造木质素的单体组分提供了减少其顽固性的吸引人的潜力。本发明提供了在拟南芥(Arabidopsis)中开发的用于过量产生稀少木质素单体的新策略，该单体以聚合物中的端基纳入并且减少了木质素链延伸。通过在拟南芥花序梗的木质化组织中表达细菌羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL)来实现这些“木质化终止剂’ ’的生物合成。HCHL切割羟基肉桂酰基-辅酶A木质素前体的丙素(propanoid)侧链以产生相应的羟基苯甲醛。与野生型植物相比，来自表达HCHL的植物的茎积累较高量的羟基苯甲醛和羟基苯甲酸衍生物。这些C6C1酚类的部分是从植物组织中醇-可提取的并且在温和的碱水解时从不含提取物的细胞壁中释放。与野生型植物相比，具有中等HCHL活性水平的工程改造的植物没有显示出总木质素、糖含量和生物质产率的减少。然而，通过2D-NMR表征的细胞壁揭示了在芳香区中新 的分子的存在并且对从这些植物中分离的木质素的分析揭示了增加的C6C1酚类端基的量和降低的分子质量分布。另外，这些工程改造的种系显示出预处理的细胞壁生物质的糖化改善。在木质素中强化的C6C1酚类端基的引入代表了改变木质素结构和降低细胞壁对于酶促水解的顽固性的希望的策略。

【发明内容】

[0007]在第一个方面，本发明提供了包括编码羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL)和异源启动子的多核苷酸序列的分离的表达盒，并且该启动子与该多核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方式中，HCHL是突光假单胞菌(Pseudomonas f luorescens) HCHL,其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，在表达盒中使用的启动子是次生细胞壁特异性启动子，如PIRX5，其在SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列中。
[0008]在第二个方面，本发明提供了用于工程改造具有降低的木质化的植物的方法。所述方法包括以下步骤:(I)将本文所述的表达盒转导进入植物；以及(2)在表达HCHL的条件下培养该植物，从而减少该植物中的木质化。在一些实施方式中，植物选自拟南芥、杨树、桉树、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒、甘鹿、松树、苜猜、小麦、大豆、大麦、草皮草、烟草、大麻、竹子、油菜、向日葵、柳树和短柄草。
[0009]在第三个方面，本发明提供了通过本文所述方法工程改造的植物，来自这样的植物的植物细胞，来自这样的植物的种子、花、叶或果实，含有本文所述的表达盒的植物细胞，以及包括来自本文所述的植物或植物的部分的植物组织的生物质。因此，本发明提供了包括与启动子可操作地连接的异源羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL)的工程改造的植物。在一些实施方式中，编码异源HCHL的多核苷酸被整合进入植物基因组中。在一些实施方式中，启动子对于植物是异源的。在一些实施方式中，所述启动子是内源性启动子。在一些实施方式中，所述启动子是次生细胞壁特异性启动子，如IRX5启动子。在一些实施方式中，HCHL是突光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens) HCHL。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。在一些实施方式中，植物选自拟南芥、杨树、桉树、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒、甘蔗、松树、苜蓿、小麦、大豆、大麦、草皮草、烟草、大麻、竹子、油菜、向日葵、柳树和短柄草。
[0010]在其它方面，本发明提供了使用本发明的工程改造的植物、植物的部分或包括来自植物的材料的植物生物质的方法。在一些实施方式中，与未经过改性以表达HCHL的野生型植物相比，在糖化反应，例如酶促糖化中使用植物材料以增加的效率水平产生可溶的糖。在一些实施方式中，与野生型植物相比，使用该植物、植物的部分或植物生物质材料来增加生物质产率或对于木材工业(如造纸、制浆和建筑)简化下游的加工。在一些实施方式中，使用该植物、植物部分或植物生物质材料来提高用于建筑目的的木材的品质。在一些实施方式中，能够在燃烧反应、气化、热解、或多糖水解(酶促或化学)中使用该植物、植物部分或植物生物质材料。在一些实施方式中，与野生型植物相比，该植物、植物部分或植物生物质材料被用作更易于消化的饲料。
【专利附图】

【附图说明】
[0011]图1.HCHL-介导的羟基肉桂酰基-辅酶A转化为羟基苯甲醛。HCHL进行羟基肉桂酰基-辅酶A (R = H，香豆酰-辅酶A ;R = OH,咖啡酰-辅酶A ;R = OCH3,阿魏酰-辅酶A)的水合和切割通过相应的反应中间体4-羟基苯基-β -羟基丙酰基-辅酶A产生羟基苯甲醛(R = H，4-羟基苯甲醛；R = 0Η，3，4-二羟基苯甲醛；R = OCH3,4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)和乙酰辅酶A。
[0012]图2.在IRX5: HCHL品系中HCHL表达的分析。(A)用分离自Tl代中5个独立的5周龄转化体的次生茎(secondarystem)的mRNA通过RT-PCR检测HCHL转录物。使用由纯化自野生型(WT)茎的mRNA合成的cDNA作为阴性对照。使用Tub8_特异性引物来评价每个样品的cDNA量。(B)通过使用通用抗体和5 μ g的提取自在T2代中5个5周龄的IRX5: HCHL转化体的初级莖(primarystem)的总蛋白对AttB2肽(大小约32kDa)标记的HCHL的western印迹的检测。来自野生茎(WT)的蛋白提取物被用作阴性对照。
[0013]图3.来自5周龄拟南芥植物的茎切片的组织化学染色。㈧MSule染色。(B)间苯三酚-HCl染色。(C)甲苯胺蓝O染色。i，束间纤维；x，木质部。对于㈧和⑶标尺表不50 μ m,对于(C)表不20 μ m。注意品系IRX5: HCHL(4)中观察到的塌缩的木质部导管(黄色箭头)。
[0014]图4.1RX5: HCHL和野`生型植物的光谱分析。(A)使用FT-拉曼光谱的在来自野生型(WT)和品系IRX5: HCHL(2)的成熟衰老茎的CWR中木质素和多糖的含量。数值代表在1555-169001^1和ΙΟΙΟ-ΙΠδα1的范围内积分强度,其分别用于木质素和多糖(纤维素/半纤维素)定量。数值是3个生物重复样的平均值土SE。⑶从野生型和品系IRX5: HCHL(2)的茎基(basal stem)切片中木质部(黑线)和束间纤维(灰线)得到的FT-1R光谱的比较。对于野生型对于转基因的吸收值以及图对于波数进行斯氏t检验。在每个波长上，-2和+2之间的区域对应于两种测试的基因型之间没有显著差异(P-值〈0.05)。显著阳性的t_值表示在野生型中吸收值高于IRX5: HCHL植物。
[0015]图5.品系IRX5: HCHL植物的2D-HSQC NMR谱分析。来自野生型(WT)茎(A)和来自IRX5: HCHL(FCAl)茎(B)的木质素的2D-HSQC NMR谱；差异图谱(IRX5: HCHL⑵-野生型)显示在芳香区(C)中存在新的组分。
[0016]图6.纯化自野生型和品系IRX: HCHL⑵植物的茎的CEL木质素的多分散性概况。使用㈧UV-A3qq吸收和⑶UV-Fex25Q/em45Q荧光得到SEC色谱。
[0017]图7.来自IRX5: HCHL和野生型植物的成熟衰老茎的生物质的糖化。用DNS试验测量从IOmg的热水、稀释的碱或稀释的酸预处理然后72小时酶促水解后的生物质释放的还原糖的量。数值是4个生物重复样的平均值土SE。
[0018]图8.荧光假单胞菌HCHL (SEQ ID NO:1)和其它同源蛋白的氨基酸序列的比对。
[0019]图9.在拟南芥中IRX5启动子的器官和组织特异性活性。使用含有pIRX5:⑶S表达盒的品系CS70758来使得IRX5启动子的活性局部化。在37°C下，幼苗(A和B)、玫瑰花结叶(C和D)、长角果(E和F)、茎生叶(G和H)、花(I和J)以及花序梗(K和L)在GUS试验缓冲液中孵育I小时和8小时。在I小时的孵育后(K)基本在茎木质部导管中检测到Gus活性。对于较长的孵育(8小时)，也在茎(L)的束间纤维、幼苗(A)的维管系统、长角果(F)、玫瑰花结(D)和茎生叶(H)以及花柱和花药(J)中观察到GUS染色。X:木质部导管，if:束间纤维。比例尺:2mm(A-B，E-F)，4mm(C-D，G-H)，500ym(1-J)，100ym(K-L)。
[0020]图10.在不同阶段IRX5: HCHL和野生型(WT)植物的生长和发育。(A) 3周龄玫瑰花结(B) 5周龄开花阶段 。(C) 8周龄衰老阶段。
[0021]图11.HCHL活性后C6C1酚类产生的合成和可能相关的酶。表示了苯丙素途径(中间框)和单体木质醇途径(左框)。HCHL将羟基肉桂酰基-辅酶A转化为它们相应的羟基苯甲醛。代谢数据显示羟基肉桂酸和醇的出现，这表明醛脱氢酶(DH)和还原酶的参与(左框)。Μ)Ρ-葡糖基转移酶(UGT)导致C6-C1酚基葡萄糖偶联物的形成。在依次单加氧酶(Monox)和O-甲基转移酶活性(OMT)之后，丁香醛可能衍生自香草醛和50H-香草醛。星号表示在表达HCHL的拟南芥的木质素中发现较高含量的化合物。酶的缩写如下:PAL，苯丙氨酸解氨酶；C4H，肉桂酸酯4-羟化酶；4CL，4-香豆酸酯-辅酶A连接酶；CCR，羟基肉桂酰基-辅酶A还原酶；CAD，松柏醇脱氢酶；HCT，对羟基肉桂酰基-辅酶A:奎尼酸莽草酸对羟基肉桂酰基-辅酶A转移酶；C3H，对香豆酸酯3-羟化酶；CCoAOMT，咖啡酰-辅酶A O-甲基转移酶；F5H，阿魏酸5-羟化酶(松柏醛5-羟化酶)；C0MT，咖啡酸/5-羟基阿魏酸O-甲基转移酶。
[0022]图12.表达pAtIRX5:: HCHL的转基因水稻品系。
[0023]图13.在工程改造水稻品系中HCHL的表达分析。使用从水稻植物和HCHL-特异性引物的RNA的RT-PCR的结果。
[0024]图14.来自工程改造的 水稻品系的茎中pHBA的检测。
[0025]发明详述
[0026]1.定义[0027]如本文所述，术语“羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶’’或“HCHL’’是指催化木质素前体对-香豆酰-辅酶A、咖啡酰-辅酶A或阿魏酰-辅酶A硫酯的双键的水合的酶，其然后通过反醒醇切割(retro aldol cleavage)反应来产生相应的C6C1轻基苯甲醛和乙酰辅酶A。在本发明的含义中的典型HCHL是来自荧光假单胞菌细菌的HCHL(EC4.2.1.101-反式-阿魏酰-辅酶A水合酶)，其具有图11中SEQ ID NO:I (GenBank登录号CAA73502)所示的氨基酸序列，由GenBank登录号Y13067.1所示的eDNA序列或SEQID NO:2 (由新泽西州皮斯卡塔韦的GenScript公司(GenScript,Piscatway,NJ)合成)所示的密码子优化的多核苷酸序列编码。在本申请中，术语HCHL包括荧光假单胞菌HCHL的多态性变体、等位基因、突变体和种间同源物，在图8中提供了其中的一些例子。编码HCHL的核酸是指基因、前mRNA和mRNA等，包括编码本文所述的特定序列的多态性变体、等位基因、突变体和种间同源物。因此，HCHL核酸(I)与编码SEQ ID NO:1的多核苷酸序列相比(例如，SEQ ID勵:2或￥13067.1中所示的多核苷酸序列)，优选在至少约10、15、20、25、50、100、200、500或更多核苷酸的区域中或在完整多核苷酸的长度中，具有超过约50%的核苷酸序列相同性，55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%，优选91%、92%、93%、94%、95(%、96(%、97(%、98(%或99(%或更高核苷酸序列相同性的多核苷酸序列；或⑵与具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽或图8中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:4_34)中的任意一个相比，优选在至少约25、50、100、200或更多氨基酸的区域中或在完整多肽的长度中，编码具有超过约50%的氨基酸序列相同性，55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%，优选91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高氨基酸序列相同性的氨基酸序列。能够通过本领域已知或在本申请的实施例部分所述的功能性实验来验证本申请的含义内的HCHL的酶促活性，验证其将木质素前体对-香豆酰-辅酶A、咖啡酰-辅酶A和阿魏酰-辅酶A硫酯中的任意一个转化为相应的C6C1羟基苯甲醛和乙酰辅酶A的能力。
[0028]当在描述表达基本局限于特定组织的外源性HCHL的植物的内容中使用时，术语“基本局限的’’是 指与其它细胞或组织类型相比，在感兴趣的特定细胞或组织类型中产生更大量的酶促活性和改性的单体木质醇(monolignol)。在一些实施方式中，HCHL和改性的单体木质醇的存在基本局限于植物细胞的次生细胞壁和植物的茎中。
[0029]术语“多核苷酸’’和“核酸’’可互换使用，指从5'端读向3'端的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。本发明的核酸一般含有磷酸二酯键，虽然在一些情况下，可以使用可能具有另外的主链的核酸类似物，例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基氨基磷酸酯(参见Eckstein，《寡核苷酸和类似物:实践方法》(Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach),牛津大学出版社);带正电主链；非离子型主链，和非核糖主链。因此，核酸或多核苷酸也可以包括通过聚合酶允许正确通读的改性的核苷酸。“多核苷酸序列’’或“核酸序列’’包括单个单链或双螺旋中的核酸的正义链和反义链。本领域技术人员会理解，单链的描述也能确定互补链的序列；因此本文所述的序列也提供该序列的互补。除非另有说明，具体核酸序列也包括其变体(如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。核酸可以是DNA，包括基因组DNA和cDNA，RNA或杂交体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。
[0030]在两种核酸或多肽的内容中使用的术语“基本相同’’是指一条序列与参照序列相比具有至少50%的序列相同性。百分比相同性可以是50%-100%之间的任意整数。使用本文所述的程序与参照序列比较，一些实施方式包括至少50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列相同性；优选使用标准参数的BLAST，如下述。例如，HCHL可以具有与荧光假单胞菌HCHL的氨基酸序列 SEQ ID NO:1 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列。
[0031]当如下述比对最大对应性时，如果在两条序列中核苷酸或氨基酸残基的序列分别是相同的，两条核酸序列或多肽序列被称为“相同的’ ’。在两条或更多条核酸或多肽序列内容中的术语“相同的’’或“相同性’’指就比较窗的最大对应性进行比较和比对时，相同或有特定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸的两条或更多条序列或亚序列，如使用下列序列比较算法之一或通过手工比对和目测测量。序列相同性百分比涉及蛋白和肽使用时，认为不同的残基位置通常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不改变分子的功能性质。当序列由于保守取代而不同时，序列相同性百分比可上调以根据该取代的保守性质校正。进行该调整的方法为本领域技术人员公知。通常其涉及将保守取代作为部分评分而不是完全错配，从而增加序列相同性百分比。因此例如，相同氨基酸得分为1，非保守取代得分为0，保守取代得分为0-1。保守取代的评分按照，例如Meyers和Miller的算法，Computer Applic.Biol.Sc 1.4:11 -17 (1988)，例如，如在程序PC/GENE (美国加利福尼亚州芒廷维尤的智慧遗传公司(Intelligenetics, Mountain View, California, USA))中执行的进行计算。
[0032]对于序列比较，一般将一种序列用作与测试序列比较的参照序列。使用序列比较算法时，测试和参照序列均输入计算机，必要时指定子序列坐标，指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或者可指定另外的参数。然后，该序列比较算法根据程序参数计算出测试序列相对于参照序列的序列相同性百分数。
[0033]本文所用的“比较窗’’包括参`考选自20-600，通常约50-200，更常见约100-150数量的毗连位置的区段，对两个序列进行最优比对后，可将该区段的序列与相同数量的毗连位置的参比序列作比较。比对序列的比较方法是本领域熟知的。可进行最优序列比对以作比较，例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2:482(1981);通过 Needleman 和 Wunsch 的同源性比对算法，J.Mol.Biol.48:443(1970);通过 Pearson 和Lipman的相似性搜索法，Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.USA85:2444(1988);通过计算机执行这些算法(遗传学计算组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(WisconsinGenetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，575 科学大道(ScienceDr.)，威斯康星州麦迪逊(Madison，WI))，或通过手工比对和目测。
[0034]适合测定序列相同性百分数和序列相似性百分数的算法是BLAST和BLAST2.0算法，分别描述于 Altschul 等(1990) J Mol.Biol.215:403-410 和 Altschul 等(1977)NucleicAcids Res.25:3389_3402。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information) (NCBI)网站从公共渠道获得。此算法包括:首先通过鉴定查询序列中长度为w的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分Τ。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。然后，沿各个序列在两个方向上延伸该字命中，直到提高累积的比对评分。就核苷酸序列而言，采用参数M(—对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是〈O)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸:累积比对评分比其最大获得值降低X ;由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数w、T和X决定比对的灵敏度和速率。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值如下:字长(W) 28，期望值(E)10，M= 1，Ν = -2，以及比较两条链。就氨基酸序列而言，BLASTP程序使用默认参数，字长(W) 3、期望值(E) 10、使用BLOSUM62评分矩阵(参见HenikofT和Henikoff (1989)Proc Natl Acad Sci USA89:10915 (1989))。
[0035]BLAST算法也对两种序列间的相似性进行统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul, Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA90:5873-5787 (1993))。BLAST 算法提供的一种相似性测量是最小概率和(P (N))，它表明两个核苷酸或氨基酸序列之间偶尔发生匹配的概率。例如，如果测试核酸与参比核酸的比较中最小概率和小于约0.01，更优选小于约10_5，最优选小于约10_2°，则认为该核酸与参比序列相似。
[0036]与参照序列基本相同的核酸或蛋白序列包括“保守修饰的变体’ ’。对于特定的核酸序列，保守修饰变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置上，可将所述密码子改变成所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。这类核酸变异是“沉默变异’’，这是保守修饰变异的一种。本文编码多肽的每种核酸序列也描述该核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员应认识，可修饰核酸中的每个密码子(除了 AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)，以产生功能相同的分子。因此，在所述的各序列中隐含了编码多肽的各核酸沉默变异。
[0037]至于氨基酸序列，本领域技术人员会认识到，在编码序列中改变单个氨基酸或较少百分数氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白序列中的单独取代是“保守修饰变体’’，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸所取代。提供功能上相似氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。
[0038]以下六组各自含有可互相保守取代的氨基酸:
[0039]I)丙氨酸(A)，丝氨酸⑶，苏氨酸⑴；
[0040]2)天冬氨酸⑶，谷氨酸(E)；
[0041]3)天冬酰胺(N)，谷胺酰胺(Q)；
[0042]4)精氨酸(R)，赖氨酸⑷；
[0043]5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V);和
[0044]6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
[0045](参见例如，Creighton,Proteins (1984))。
[0046]核苷酸序列基本相同的另一个标志是在严谨条件下，两个分子是否互相杂交，或与第三个核酸杂交。严谨条件是序列依赖性的，在不同情况下不同。通常，严谨条件选择为比特定序列在确定离子强度和pH下的热解链点(Tm)低约5°C。Tm是50%的目标序列与完美配合探针杂交时的温度(在确定离子强度和PH的条件下)。通常，严谨条件是在pH7下盐浓度为约0.02摩尔/升并且温度为至少约60°C的条件。例如，杂交，如在印迹技术中RNA-DNA杂交的严谨条件包括在55°C下20分钟或等价条件下的0.2X SSC中的一次洗涤。
[0047]术语“启动子’’是指在细胞中能够驱动DNA序列转录的多核苷酸序列。因此，在本发明的多核苷酸构建体中使用的启动子包括参与调节或调整基因转录的周期和/或速率的顺式和反式作用的转录控制元件、翻译控制元件(5’UTR:未翻译区域)和调节序列。例如，启动子能够是包括参与转录调节的增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5'和3'未翻译区域或内含子或外显子区域的顺式作用转录控制元件。顺式作用序列通常与蛋白或其它生物分子相互作用来进行(打开/关闭、调节、调整等)基因转录。启动子位于转录的基因的5'端，并且如本文使用，包括距离翻译起始密码子的序列5'端(例如，包括mRNA的5'未翻译区域，通常包括50-200bD)。最常见地，核心启动子序列位于距离翻译起始位点l_3kb以内，更经常位于Ikbp以内并且经常位于翻译起始位点500bp以内。按照习惯，启动子序列以其控制的基因的编码链上的序列提供。
[0048]“组成型启动子’’是能够在几乎所有细胞类型中引发转录的启动子，其中“细胞类型特异性启动子’’仅仅在一种或一些特定细胞类型或细胞组形成的组织中引发转录。在一些实施方式中，启动子是次生细胞壁特异性的。次生细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素组成并且沉积在植物的一些但不是全部的组织中，如木质组织。本文使用的“次生细胞壁特异性’ ’启动子是指在有次生细胞壁的细胞类型，例如木质化的组织如导管和纤维中引发较高水平转录的启动子，这些木质化组织可以在树的木质细胞或树皮细胞，以及植物的其它部分如叶梗中发现。在一些实施方式中，如果在次生细胞壁中启动子引发的转录水平与该启动子在其它组织中引发的转录水平相比至少高3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更多，导致编码的蛋白基本局限于有次生细胞壁的植物细胞中，例如植物的茎，则该启动子是次生细胞壁特异性的。次生细胞壁启动子的非限制性例子包括引导以下基因表达的启动子:IRX1> IRX3、IRX5、IRX7、IRX8、IRX9、IRX10、IRX14、NSTl、NST2、NST3、MYB46、MYB58、MYB63、MYB83、MYB85、MYB103、PAL1、PAL2、C3H、CcOAMT,(:0?1、？5!1、^^4、1^(:17、040(3和040(1。参见，例如1\111^1'等，1997 ;Meyer 等，1998 Jones等，2001 ;Franke 等，2002 ;Ha 等，2002 ;Rohde 等，2004 ;Chen 等，2005 ;Stobout 等，2005 ；Brown等，2005 ;Mitsuda 等，2005 ;Zhong 等，2006 ;Mitsuda 等，2007 ;Zhong 等，2007a，2007b ；Zhou等，2009 ;Brown 等，2009 !McCarthy 等，2009 ;Ko 等,2009 ;Wu 等，2010 ;Berthet 等，2011。在一些实施方式中，启动子基本与引导IRX5基因表达的天然启动子序列基本相同(参见，在SEQ ID N0:3中含有例如IRX5的启动子和转录调节元件)。上述次生细胞壁启动子序列中的一些能够在本文提供的SEQ ID NO:36-61多核苷酸序列中找到。来源于一种植物物种的启动子可以在另一种植物物种中用于引导基因表达。
[0049]如果来源于外 来物种，或者来源于相同物种但是从其原始形式修饰，则多核苷酸对于生物体或次生多核苷酸序列来说是“异源的’ ’。例如，当编码多肽序列的多核苷酸与异源启动子所谓可操作地连接时，其表示编码多肽的多核苷酸序列衍生自一个物种而启动子序列衍生自另一个不同的物种；或者，如果两者都衍生自相同物种，则编码序列并不与启动子天然相关(例如，是遗传工程改造的编码序列，例如，来自相同物种中的不同基因，或来自不同生态型或变种的等位基因)。
[0050]术语“可操作地连接’ ’是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。通常，其是指转录调节序列对转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列促进或调整在合适宿主细胞或其它表达体系中的DNA或RNA的转录，则启动子或增强子序列可操作地连接到DNA或RNA序列。通常，可操作地连接到转录序列的启动子转录调节序列在物理上与转录序列毗连，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列，如增强子，不需要物理上毗连或紧邻它们增强转录的编码序列。
[0051]术语“表达盒’ ’是指当导入宿主细胞时，分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译的核酸构建体。没有或不能被翻译的反义和正义构建体明确地包含在该定义中。在转基因的表达和内源性基因的抑制的情况下(例如，通过反义、RNAi或正义抑制)，本领域技术人员会意识到插入的多核苷酸序列不需要是相同的，但可以是仅仅与其衍生的基因的序列基本相同的。如本文解释，这些基本相同的变体由特定核酸序列的参考特定覆盖。表达盒的一个例子是包括编码可操作地连接到启动子的HCHL蛋白的多核苷酸序列的多核苷酸构建体，该启动子对于植物细胞是异源的，表达盒可被导入该构建体。在一些实施方式中，表达盒包括编码靶向植物基因组中的位置的HCHL蛋白的多核苷酸序列，使得HCHL多核苷酸序列的表达由在该植物中存在的启动子驱动。
[0052]本文使用的术语“植物’ ’是指完整植株并且包括各倍体水平的植物，包括包括非整倍体、多倍体、二倍体和单倍体。本文使用的术语“植物部分’’是指枝条营养器官和/或结构(例如，叶、莖干和块茎)、枝条、根、花和花器官(例如，苞、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花粉囊)、胚珠(包括卵和中央细胞)、种子(包括合子、胚芽、胚乳和种皮)、果实(成熟子房)、苗和植物组织(例如，维管组织、基本组织等)以及单个植物细胞、一组植物细胞(例如，培养的植物细胞)、原生质体、植物提取物和种子。本发明所述方法可用的植物种类通常宽泛到可使用转化技术的高等和低等植物，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类和多细胞藻类。
[0053]本文使用的术语“生物质’ ’是指经加工得到产物，例如生物燃料如乙醇，或牲畜饲料，或用于造纸和制浆工业产品的纤维素的植物材料。这样的植物材料可以包括完整植株、或植物的部分，例如茎、叶、枝条、枝、根和块茎等。
[0054]术语“降低的木质化’’包括降低的木质素聚合物尺寸(例如，较小数量的单体木质醇被加入到聚合物中造成的更短的木质素聚合物链)以及降低的木质素聚合物的支化程度或减少的空间填充(也称为减少的扩张体积)。通常，当与对照植物中的平均木质素分子比较时，可通过检测到其分子量的减少或单体木质醇数量的减少至少
20%,25%,30%,40%,50%或更多来显示降低的木质素聚合物。在本申请的实施例部分中详细描述了检测降低的木质化的方法。
[0055]本文和所附权利要求书所用的单数的“一个’ ’、“一种’ ’和“这种’ ’包括复数含义，除非文中另有明确说明。因此，例如，在描述“植物细胞’’时，也包括多个这样的植物细胞。
[0056]I1.引言
[0057]通过包埋在称为木质素的芳族聚合物中的纤维素微原纤和半纤维素的多糖网络构成植物细胞壁。这个 分叉的聚合物主要由三种名为对-香豆醇(p-coumaryl alcohol)、松柏醇和芥子醇的苯丙素-衍生的酚类(即单体木质醇)组成，其代表对-羟基苯基(H)、愈创木基(guaiacyl) (G)和丁香(S)木质素单元(Boerian等,2003)。单体木质醇具有由苯环(C6)和丙烷(C3)侧链组成的C6C3碳骨架。由于其赋予植物细胞壁顽固性，木质素对于陆地植物的发育是重要的。其也提供直立生长的机械强度、赋予运输水的导管疏水性并且作用为对抗降解细胞壁的病原体的物理屏障(BOudet，2007)。值得注意的是，木质素含量和组成根据环境的生物胁迫和非生物胁迫被精细调节(Moura等，2010)。
[0058]经济上，来自植物细胞壁的木质纤维素生物质广泛用作在造纸工业中浆料生产和反刍牲畜饲料的原料。植物原料也代表用于使用工程改造的微生物生产合成分子如药物以及运输燃料的可发酵糖的来源(Keasling，2010)。然而，植物中木质素含量和浆料产率、饲料消化性或多糖酶促水解之间存在负相关(de Vriie等,2002 ;Reddy等,2005 ;Dien等，2006 ；Chen 和 Dixon, 2007 ；Dien 等，2009 ；Taboada 等,2010 ；Elissetche 等，2011 ；Studer等，2011)。因此，在植物原料中降低木质素顽固性是感兴趣的主要焦点，尤其是在木质素纤维素生物燃料领域中，其中多糖向单糖的高效酶促转化对于实现经济和环境可持续生产是很重要的(Carroll 和 Somerville, 2009)。
[0059]在陆地植物之间，木质素生物合成是充分表征的和非常保守的(Weng和Chappie，2010)。已经采用遗传修饰如参与该途径的特定步骤或其调节的基因的沉默来降低木质素含量(Simmons等,2010 ；Umezawa, 2010),但是这个方法通常导致不希望的表型，如矮态、不育、植物生物质的下降和增加的对环境胁迫和病原体的易感性(Bonawitz和Chappie,2010)。这些多效影响一般是次生细胞壁完整性缺失、毒性中间体积累、防御反应的组成型活化或其它对于植物发育和防御必要的苯丙素-衍生的代谢物消耗的结果(Li等，2008 ；Naoumkina等,2010,Gallego-Giraldo等,2011)。另外，能够通过修饰其单体组成来实现改变木质素的顽固结构和物理化学性质。例如，在木质素中纳入阿魏酸松柏酯改善了细胞壁多糖的酶促降解(Grabber等,2008)。最近，已经证明在5-羟基-G单元中的富集和在木质素中S单元的减少产生了增强的糖化效率而没有大幅影响生物质产率和木质素含量(Weng等，2010 ；Dien 等，2011 ；Fu 等，2011)。
`[0060]在本研究中，可替代的策略是减少木质素顽固性，本发明人开发了使用衍生自木质素生物合成途径的前体来增强名为C6C1酚类的非常规单体木质醇的产生的主要方法。与经典C6C3单体木质醇相比，这些苯酚单元缺少丙烷侧链并且因此具有不同的聚合性质。通常在一些木质素中以痕量发现这样的C6C1酚类并且形成所谓的“苄基端基’ ’ (Kim等，2000 ;Ralph 等，2001 ;Kim 等，2003 ；Morreel 等，2004 ;Ralph 等，2008 ;Kim和 Ralph，2010)。本发明人认为在木质素中增加的C6C1端基酚类降低其聚合度和天然分支结构。为了这个目的，来自荧光假单胞菌的羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL，EC4.2.2.101/EC4.1.2.41)在拟南芥的茎中表达。HCHL是一种催化木质素前体对-香豆酰-辅酶A、咖啡酰-辅酶A和阿魏酰-辅酶A硫酯的双键水合，随后通过反醛醇切割反应来产生相应的C6C1羟基苯甲醛和乙酰辅酶A的酶(图1 ;Mitra等，1999)。使用次生细胞壁纤维素合成酶的启动子(Cesa4/IRX5)来在茎的木质化组织(木质部和束间纤维)中限制HCHL表达并且防止在其他参与植物防御和发育的组织中羟基肉桂酰基-辅酶A的消耗(Gou等，2009 ；Luo等，2009 ；Buer等，2010 ；MiIkowski和Strack, 2010)。本文所揭示的数据表明由IRX5启动子驱动的HCHL表达对于一些细胞系在木质素含量、植物发育和生物质产率中没有显著变化。也已经证明在HCHL转基因植物的木质素中C6C1酚类积累为端基，其减少了木质素的大小并且赋予细胞壁对于酶促水解的较低顽固性。
[0061]II1.具有降低木质化的植物
[0062]A.HCHL酶的表达的修饰
[0063]在一个方面，本发明提供了用于工程改造具有降低的木质化的植物的方法。所述方法包括以下步骤:首先，向植物中导入包括编码HCHL酶的多核苷酸序列和启动子的表达盒，其中编码序列和启动子是操作性地连接安排；然后，在允许功能性HCHL的表达的条件下培养该植物以产生C6C1酚类，其能够与其它单体木质醇聚合并且由此减少该植物中的木质化。
[0064]具体地，本发明提供了工程改造具有修饰的木质素多聚体的植物，其可有减少的大小、分子量和/或改变的(尤其是减少的或较低延伸的)支化，这基本局限于植物的木质化组织中。这通过首先向植物中导入上述的表达盒，但是其尤其具有次生细胞壁特异性启动子，并且然后在表达功能性HCHL酶的条件下培养该植物。该酶将各种羟基肉桂酰基-辅酶A转化为它们相应的羟基苯甲醛，其能够直接被纳入或通过与天然单体木质醇的聚合在它们纳入木质素多聚体之前由天然的酶进一步修饰(例如，醛基的氧化或还原)。
[0065]当被导入植物时，上述的表达盒不必改变木质素含量。导管保持完整表明木质素细胞壁结构仍然牢固以防止导管破碎，但是木质素组成和性质被修饰至减少其顽固性的水平。
[0066]本领域技术人员会理解通过本文所述的表达盒向植物导入的HCHL不必与荧光假单胞菌HCHL相同，荧光假单胞菌HCHL被用于本公开的实施例部分详述的实验中。在一些实施方式中，通过表达盒向植物导入的HCHL与荧光假单胞菌HCHL基本相同(例如，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)。例如，与SEQ ID NO:1相比，变体HCHL在其氨基酸残基中有至少80185190%或95%序列相同性，特别`是8个高度保守区域中的一个或多个内(图8中所示的8个框)。
[0067]1.羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL)
[0068]在一些实施方式中，本发明的表达盒包括编码产生能够导致减少的木质化的修饰的单体木质醇的多核苷酸。这样的酶的例子是有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的荧光假单胞菌HCHL。适于在本发明中使用的HCHL的另外的例子包括图8所示的那些。也适用于本发明的是变体HCHL，其可以天然存在或经重组工程改造，得到具有(I)基本与示例性HCHL(例如，SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列和⑵通过各种科学出版物或本文所述的本领域已知的HCHL酶试验确定的将至少一种木质素前体对-香豆酰-辅酶A、咖啡酰-辅酶A或阿魏酰-辅酶A硫酯转化为相应的C6C1羟基苯甲醛的酶活性的变体。
[0069]能用于实践本发明的天然存在的HCHL的例子包括对羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶/裂解酶(HCHL)、烯酰辅酶A水合酶/异构酶(isomarase) (ECH)、阿魏酰-辅酶A水合酶/裂解酶(FCA，FerA)、以及图8所命名的那些，其氨基酸序列示于SEQ ID NO:4_34。
[0070]2.次生细胞壁特异性启动子
[0071]在一些实施方式中，编码HCHL的多核苷酸可操作地与次生细胞壁特异性启动子连接。次生细胞特异性启动子与编码HCHL的多核苷酸是异源的，换而言之，启动子和HCHL编码序列衍生自两种不同的物种。如果启动子在次生细胞壁，例如在导管和植物的纤维细胞中强表达，但在不含次生细胞壁的细胞中以低得多的水平表达或不表达，该启动子适于用作次生细胞壁特异性启动子。
[0072]在一些实施方式中，该启动子与编码次生细胞壁的纤维素合成酶Cesa4/IRX5的基因的天然启动子基本相同(例如，至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同),多核苷酸序列示于Genebank登录号 AF458083_1 和 SEQ ID NO:35，启动子 pIRX5 包含于 SEQ ID NO:3。
[0073]在一些实施方式中，次生细胞壁特异性启动子包括SEQ ID NO:3。在一些实施方式中，次生细胞壁特异性启动子包括SEQ ID NO:3的序列或其变体。在一些实施方式中，次生细胞壁特异性启动子包括SEQ ID NO:3的一段序列，该序列包括SEQ ID NO:3的约50-约100或更多个连续核苷酸。在一些实施方式中，次生细胞壁特异性启动子包括SEQ IDNO:3 的一段序列，该序列包括 SEQ ID NO:3 的 50-1000、50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100 ;75_1000、75-900、75-800、75-700、75-600、75-500,75-400,75-300,75-200 ； 100-1000、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300 或 100-200 个连续核苷酸。
[0074]次生细胞壁特异性启动子也在本领域中描述。参见,例如Mitsuda等,2005PlantCell ；Mitsuda 等，2007Plant Cell ；Zhou 等，2009plant cell ；0htani 等，2011PlantJournal。它们包含在本申请提供的多核苷酸序列SEQ ID NO:36-61中。
[0075]本领域技术人员会理解启动子区域可以耐受相当的变化而不发生活性损失。因此，在一些实施方式中，次生细胞壁特异性启动子与SEQ ID NO:3是基本相同的(例如，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)。可 通过本领域已知或本申请的实施例部分所述的报告基因(例如，β -葡糖醛酸糖苷酶或GUS)测定来确定次生细胞壁特异性启动子的功效。
[0076]B.重组表达载体的制备
[0077]当得到启动子序列和感兴趣基因的编码序列(例如，荧光假单胞菌HCHL或图8所示的任意其它HCHL)时，这些序列能用于制备在转基因植物中表达感兴趣基因的表达盒。通常，植物转化载体包括在5'和3'调节序列和选择性标记物的转录控制下的一条或多条克隆的植物编码序列(基因组或cDNA)。这样的转化载体也可含有启动子(例如，本文所述的次生细胞壁特异性启动子)、转录起始位点、RNA加工信号(如内含子剪接位点)、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。
[0078]植物表达载体可包括RNA加工信号，其可位于编码序列中、其上游或下游。另外，表达载体可包括取自植物基因的3'-未翻译区域的调节序列，例如3'终止子区以增加mRNA的mRNA稳定性，如土豆的P1-1I终止子区或章鱼碱合酶或胭脂氨酸合成酶Y终止子区。
[0079]植物表达载体通常也包括选择性标记物基因以使转化体易于选择。这样的基因包括编码抗生素抗性基因(例如，对潮 霉素、卡那霉素、博来霉素、G418、链霉素或壮观霉素的抗性)、除草剂抗性基因(例如，草胺膦乙酰基转移酶)和编码阳性选择酶的基因(例如，甘露糖异构酶)。
[0080]一旦已经构建了包括编码HCHL并且与启动子(尤其是次生细胞壁特异性启动子)可操作连接的多核苷酸的的表达盒，可使用标准技术来将该多核苷酸导入植物来表达HCHL并且完成减少的木质化。参见，例如Ammirato等《植物细胞培养手册-作物品种》(Handbookof Plant Cell Culture—Crop Species),麦克米兰出版公司(Macmillan Publ.C0.) 1984 ；Shimamoto 等，Nature338:274-276,1989 ；Fromm 等，Bio/Technology8:833-839,1990 ；和Vasil 等，Bio/Technology8:429-434,1990 中所描述的方案。
[0081]植物的转化和再生在本领域中已知，并且由实践者确定最合适转化技术的选择。合适的方法可包括但不限于:植物原生质体电穿孔；脂质体介导的转化；聚乙二醇(PEG)介导的转化；使用病毒的转化；植物细胞的微注射；植物细胞微粒轰击；真空浸润；和根瘤土壤杆菌介导的转化。转化意味着以引起所述序列稳定或瞬时表达的方式将核苷酸序列引入植物中。这些方法在不同植物中的示例包括:美国专利第5，571，706 ;5，677，175 ；5，510，471 ;5，750，386 ;5，597，945 ;5，589，615 ;5，750，871 ;5，268，526 ;5，780，708 ；5，538，880 ;5，773，269 ;5，736，369 和 5，610，042 号。
[0082]转化以后，能采用掺入转化载体的选择性标记物选择植物。通常，这种标记物将赋予转化植物抗生素或除草剂抗或在特定基质中生长的能力，并且可通过将所述植物暴露于适当浓度的所述抗生素、除草剂或基质而实现转化株的选择。
[0083]能按照本领域中任意已知方法得到编码HCHL的多核苷酸序列以及包括启动子(例如，次生细胞壁特异性启动子)的多核苷酸序列。这样的方法可包括扩增反应如聚合酶链反应(PCR)和其它基于杂交的反应或能够被直接合成。
[0084]C.其中能降低木质化的植物
[0085]如本文所述，包括编码与启动子，特别是次生细胞壁特异性启动子可操作连接的HCHL的多核苷酸的表达盒能在多种植物中表达。该植物可以是单子叶植物或双子叶植物。在本发明的一些实施方式中，该植物`是绿色种植植物。在一些实施方式中，该植物是裸子植物或松柏类植物。
[0086]在一些实施方式中，该植物是适于产生生物质的植物。合适的植物的例子包括，但不限于拟南芥、杨树、桉树、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒、甘蔗、松树、苜蓿、小麦、大豆、大麦、草皮草、烟草、大麻、竹子、油菜、向日葵、柳树、麻风树和短柄草。
[0087]在一些实施方式中，被本发明的表达盒导入的植物与衍生出启动子的植物是相同物种的植物。在一些实施方式中，被表达盒导入的植物是与衍生出启动子的植物物种不同物种的植物。
[0088]D.降低木质化的植物的筛选
[0089]在选择转化的植物之后，可以评估植物或植物的部分来确定是否能够检测到外源性HCHL的表达，例如通过评估RNA或蛋白的水平，通过测量HCHL的酶活性以及评估在植物中发现的木质素分子的大小、分子量、含量或其中支化的程度。能够使用本领域已知的任意数量的方法实施这些分析。
[0090]在一些实施方式中，通过评估RNA或蛋白的水平来筛选植物。测量RNA表达的方法在本领域中已知并且包括，例如PCR、northern分析、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和微阵列。测量蛋白水平的方法也在本领域中已知并且包括，例如质谱或基于抗体的技术，如ELISA, Western印迹、流式细胞术、免疫荧光法和免疫组织化学。
[0091]在一些实施方式中，通过测量HCHL活性，也通过评估木质素大小和组成来筛选植物。HCHL的酶学试验在本领域中熟知并且在本申请中描述。例如，能通过核磁共振(NMR)、分光光度法、显微分析、克拉松(klason)木质素测定、乙酰-溴化物试剂或通过组织化学染色(例如，用间苯三酚)来评价木质素分子。
[0092]IV.使用降低木质化的植物的方法
[0093]来自由于外源性HCHL在次生细胞壁中的表达而具有降低木质化的植物的植物、植物部分或植物生物质材料能够用于多种方法。在一些实施方式中，与野生型植物相比，植物、植物的部分或植物生物质材料产生较低顽固性生物质用于转化反应。在一些实施方式中，植物、植物的部分或植物生物质材料被用于糖化反应，例如，酶促糖化，与野生型植物相t匕，以增加的效率水平产生可溶性糖。在一些实施方式中，与野生型植物相比，使用植物、植物的部分或植物生物质材料来增加生物质产率或对于木材工业(如造纸、制浆和建筑)简化下游的加工。在一些实施方式中，使用该植物、植物部分或植物生物质材料来提高用于建筑目的的木材的品质。在一些实施方式中，能够在燃烧反应、气化、热解、或多糖水解(酶促或化学)中使用该植物、植物部分或植物生物质材料。在另外的实施方式中，植物、植物的部分或植物生物质被用作饲料作物并且与野生型植物相比展现出改善的可消化性。
[0094]转化的方法，例如生物质气化，在本领域中已知。简单来说，在气化中，植物或植物生物质材料(例如，叶和茎)被研磨为小颗粒并且与受控的量的空气或氧气以及蒸汽仪器进入气化器。反应的热和压力将生物质的化学键分裂，形成合成气，其随后经清洁去除如硫、汞、颗粒和痕量物质的杂质。合成气然后能被转化为产品如乙醇或其它生物燃料。
[0095]酶促糖化的方法也为本领域熟知。简单来说，任选地用热水、稀释的碱、AFEX (氨纤维爆破)、离子液体或稀释的酸预处理植物或植物生物质材料(例如，叶和茎)，然后在缓冲液中使用细胞壁水解酶混合物`(如半纤维素酶、纤维素酶和糖苷酶)酶促糖化并且孵育植物或植物生物质材料与酶混合物。在孵育之后，能通过使用糖检测的标准方法测量减少的释放糖的量来确定糖化反应的产率，例如本领域技术人员熟知的二硝基水杨酸方法。与野生型植物相比，按照本发明工程改造的植物提供了较高的糖化效率，同时植物生长、发育或疾病耐受性没有受到负面影响。
[0096]从使用本发明的植物生物质的糖化反应产生的糖能用于产生任意产物，该产物中糖能用作碳源。产物的例子包括，但不限于醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，比和0)2);抗生素(例如，青霉素和四环素)；维生素(例如，核黄素、Β12、β-胡萝卜素)；脂肪酸和脂肪酸衍生物(如PCT/US2008/068833中所述)；异戊二烯链烷酸酯(isoprenylalkanoates)(如 PCT/US2008/068756 中所述)，甲基丁烯醇(如 PCT/US2008/068831 中所述)；脂肪酸酯(如PCT/US2010/033299中所述)，基于类异戊二烯衍生的柴油燃料(如PCT/US201I/059784中所述)；由聚酮合成酶合成的聚酮，如二元酸(参见，例如PCT/US201I/061900)，生物燃料(参见，例如PCT/US2009/042132)和α-烯烃(参见，例如PCT/US201I/053787)。
实施例[0097]提供以下实施例用于说明而非限制本发明的权利要求。
[0098]实施例1:在拟南芥中细菌HCHL的表达
[0099]1.材料与方法
[0100]植物材料和生长条件
[0101]拟南芥(Arabidopsis thaliana)(哥伦比亚生态型，Col-Ο)种子直接在土壤上发芽。生长条件为每天14小时IOOymol π Υ1的光照，22°C，55%湿度。在用1%蔗糖、1.5%琼脂(西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich))补充调节至ρΗ5.6-5.8并且含有50 μ g ml/1卡那霉素的固体Murashige和Skoog维生素培养基(植物技术实验室(PhytoTechnology Laboratories))上进行Tl和T2纯合转基因植物的选择。
[0102]化学品
[0103]4-羟基苯甲酸、3，4-二羟基苯甲酸、香草酸、4-羟基苯甲醛、香草醛、5-羟基香草醛、4-羟基苄醇、香草醇和1-甲基-2-吡咯烷酮购自西格玛-艾尔德里奇公司。香草酸、丁香酸、3，4-二羟基苯甲醛、丁香醛和芥子醇购自阿法埃莎公司(Alfa Aesar) 0 5-羟基香草酸从美国中草药公司(ChiOmadex)获得，并且3，4_ 二羟基苄醇从TCI美国公司(TCIAmerica)获得。
[0104]pIRX5:⑶S品系和⑶S染色
[0105]拟南芥品系CS70758(哥伦比亚生态型，Col-2)从拟南芥生物资源中心(ABRC)获得。该品系具有含有由位于 与GUS基因融合的CESA4起始密码子上游的基因组片段组成的表达盒的pMLBART质粒。如前述分析组织化学⑶S活性(Eudes等，2006)。在37°C下，土壤生长品系CS70758的各种器官在使用5-溴-4-氯-3-吲哚基-D-葡糖醛酸(Indofine化学公司(Indofine Chemical Company, Inc.))作为底物的⑶S试验缓冲液中孵育1-8小时。在染色之后，在显微镜(莱卡公司(Leica))下观察之前使用振动切片机将茎样品(Icm)横向切片(80 μ m) ο
[0106]IRX5 =HCHL构建体和植物转化
[0107]为了在拟南芥中的HCHL表达，使用衍生自PPZP212的二元载体pTKan (Hajdukiewicz 等，2004)。Gateway 克隆盒(英杰公司(Invitrogen))被插入到 XhoI和PstI的限制性位点之间以产生pTKan-GW载体。从拟南芥(哥伦比亚生态型，Col-Ο)基因组 DNA 中用寡核苷酸 5’ -CCCGGCGGCCGCATGAAGCCATCCTCTACCTCGGAAA-3’ 和 5’ -CCCGGCTAGCGGCGAGGTACACTGAGCTCTCGGAA-3，(Nod和NheI限制性位点用下划线表示)通过PCR扩增IRX5启动子的核苷酸序列，并且在pTKan-GW的ApaI和SpeI限制性位点之间插入产生pTKan-pIRX5-GW表达载体。合成不含种植密码子的用于在拟南芥中表达的编码来自荧光假单胞菌AN103 (登录号CAA73502)的HCHL酶的密码子优化的核苷酸序列(金斯瑞(Genescript))并且用寡核苷酸 5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTACTTACGAGGGAAGATGG-3’ 和 5’ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCTCTTGTAAGCCTGGA GTCC-3’ (attbl和attb2位点用下划线表示)通过PCR扩增来克隆进入Gateway pD0NR221_fl进入载体(Lalonde等，2010)。测序验证的HCHL进入克隆与pTKan-pIRX5_GW载体LR重组以产生最终的IRX5: HCHL构建体。该构建体通过拟南芥介导的转化导入野生型拟南芥植物(生态型 ColO)中(Bechtold 和 Pelletier,1998)。
[0108]RNA 提取和 RT-PCR[0109]用植物RNeasy提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从IRX5: HCHL Tl转化体和野生型植物的花序梗中提取的总RNA (I μ g)用Transcriptor First Strand cDNA合成试剂盒(罗氏应用科学公司(Roche applied Science))进行逆转录。对所得的cDNA制备物进行质量控制以用于使用tu砧-特异性寡核苷酸(5’-GGGCTAAAGGACACTACACTG-3’/V-CCTCCTGCACTTCCACTTCGT CTTC-3’)的 PCR。使用寡核苷酸 5’-ATGTCTACTTACGAGGGAAGATGG-3’和 5’ -TCTCTTGTAAGCCTGGAGTCC-3’ 用于通过 PCR 检测 HCHL 表达。
[0110]Western 印迹分析
[0111]为了蛋白提取，IRX5: HCHL T2转化体和野生型植物的花序梗在液氮中研磨，并且在1400rpm下用提取缓冲液[IOOmM Tris-HCl pH6.5,2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，2%(ν/ν) β -巯基乙醇，I % (w/v) SDS]对0.25g的所得的粉末进行匀化30分钟。混合物在20，OOOg下离心5分钟并且收集上清用于使用Bradford法(Bradford, 1976)和牛血清白蛋白作为标准的蛋白定量。对于电泳，可溶性蛋白(5yg)与0.2M Tris-HCl, pH6.5,8% (w/v) SDS,8% (ν/ν) β-巯基乙醇，40% (ν/ν)甘油和0.04% (w/v)溴酚蓝混合并且在40°C下孵育30分钟。通过使用8-16% (w/v)聚丙烯酰胺梯度凝胶(英杰公司)的SDS-PAGE分离蛋白并且电转(100伏，45分钟)到PVDF膜(赛默飞世尔科学公司(Thermo FisherScientific))上。印迹的膜在含有 2% (w/v)脱脂奶粉的 TBS-T(20mM Tris-HCl, 150mMNaCl，0.1% (ν/ν)吐温20，ρΗ7.6)中孵育I小时，并且用通用抗体(I: 20000)在含有2%(w/v)脱脂奶粉的TBS-T中过夜孵育。然后在TBST-T中洗涤膜30分钟并且在含有2% (w/V)脱脂奶粉的TBS-T中与辣根过氧化物酶偶联的抗兔二抗(I: 20000;西格玛-艾尔德里奇公司)孵育I小时。然后在TBS-T中洗涤膜30分钟，并且通过使用SuperSignal WestDura Extended Duration Substrate (赛默飞世尔科学公司)的化学发光实施检测。
[0112]HCHL 活性
[0113]为了蛋白提取， IRX5: HCHL T2转化体和野生型植物的花序梗在液氮中研磨，并且用25mg的聚乙烯基聚吡咯烷酮和1.25mL的提取缓冲液(EB ；IOOmM Tris-HCl, pH8.5，20mM DTT和IOmM Na2EDTA)对0.25g的所得粉末进行匀化。在4°C下在1400rpm下振摇提取物15分钟，并且在4°C下在20，OOOg下离心30分钟。收集上清，用EB调至2.5mL并且加到用25mL的EB预平衡的HHO柱(GE卫生保健公司(GE healthcare))上。用3.5mL的EB稀释蛋白并且用Bradford法(Bradford，1976)和牛血清白蛋白作为标准来定量。
[0114]对于HCHL活性，在30°C下用在IOOmM Tris-HCl pH8.5中的150 μ M阿魏酰-辅酶A中孵育5 μ L的蛋白提取物15分钟，总体积50 μ L0每个反应的蛋白总量在4-6.5 μ g之间变化。用50yL冷酸化的甲醇(12%冰醋酸/88%甲醇，ν/ν)终止反应并且在_70°C下保存直到LC-MS分析。
[0115]生物质
[0116]对于生物质测量，IRX5: HCHL和野生型植物生长直至衰老并且在称重前收集不含根、叶和长角果的干燥的茎。使用ANOVA然后雪费(SchefTe)事后检验来实施统计学分析。
[0117]显微观察
[0118]5周龄的植物被用于显微观察。在第一和第二节间之间切下的茎区段在4%琼脂糖中包埋。使用振动切片机(Leica公司)得到茎半薄切片(100-μ μπι厚)。对于甲苯胺蓝O(TBO)染色，在水中TBO(西格玛-艾尔德里奇公司)的0.05% (w/v)溶液中孵育切片30秒并且用水清洗。对于Wiesner木质素染色，切片在间苯三酚-HCl试剂(VWR国际(VWR国际公司))中孵育3分钟并且用水清洗。对于Maule木质素染色，切片在4% KMnO4中孵育5分钟，用水清洗，在37% HCVH2O(I: I, ν/ν)中孵育2分钟，并且在加入I滴氨水后观察。立即使用亮场光学显微镜(Leica DM4000B)观察切片。
[0119]可溶性酚类提取
[0120]对于甲醇可溶性酚类的提取，大约200mg的冷冻茎粉末与ImL的80% (ν/ν)甲醇-水混合并且在1400rpm下振摇I小时。在LC-MS分析之前,通过离心(5分钟，20000g)清洁提取物，与400 μ μ L的分析级纯的水混合并且用Amicon超速离心滤膜(3，OOODa MW截止值的再生纤维素膜；密理博(Millipore))过滤。另外，等份的过滤的提取物在真空下干燥，用IN HCl重悬并且在95°C下孵育3小时来酸水解。混合物经过3次乙酸乙酯分配步骤。收集乙酸乙酯部分，真空中干燥，并且在LC-MS分析之前在50% (ν/ν)甲醇-水中重悬。
[0121]细胞壁结合酚类提取
[0122]对于细胞壁结合酚类的提取，收集不含叶和长角果的成熟衰老的茎，并且用MixerMill MM400(雷太克公司(Retsch))和不锈钢球以30s—1持续2分钟将其球磨成细粉末。通过依次用Iml的95°C的96%乙醇洗涤2次30分钟，和用ImL的70%乙醇涡旋2次30秒的得到不含提取物的细胞壁残留物(CWR)。所得的CWR在30°C下过夜真空干燥。大约6mg的CffR与500 μ μ L的2Μ NaOH混合并且在30°C下在1400rpm下振摇24小时。用100 μ μ L的浓HCl酸化混合物，并且经过3次乙酸乙酯分配步骤。收集乙酸乙酯部分，真空中干燥，并且在LC-MS分析之前在50% (ν/ν)甲醇-水中悬浮。
[0123]LC-MS
[0124]使用1200系列HPLC系统(安捷伦技术公司(Agilent Technologies Inc.))在Poroshel 1-120柱(150mm长,3mm内径,2.7 μ μπι粒度)上进行C6C1酹酸和醒的分离。使用水中0.1 %甲酸作为溶剂A和乙腈-水(98:2,ν/ν)中0.1 %甲酸作为溶剂B的流动相组成的梯度洗脱来分离分析物。洗脱的梯度为0-5分钟13% B, 5-7分钟50% B, 7-8分钟50% B以及8-11分钟13% B，流速0.55mL分钟―1。HPLC系统通过1: 7柱后分流与安捷伦6210飞行时间(TOF)质谱(MS)联用。在阳离子模式下使用电喷雾电离(ESI)进行分析。在全扫描模式中以光谱.秒―1和使用以下参数的1.176秒.光谱―1的循环时间进行[M+H]+离子的检测:毛细管电压3500V，碎裂电压(fragmentor)165V，锥孔电压(skimmer) 50V和OCTRF170V，干燥气流速9L分钟―1，喷雾器压力15psig，干燥气温度325°C。在相同的HPLC和MS系统中使用相同的HPLC柱进行C6C1酚醇的分离。使用水中0.1 %甲酸作为溶剂A和乙腈-水(98:2，ν/ν)中0.1 %甲酸作为溶剂B的流动相组成的梯度洗脱来分离分析物。洗脱条件与上述相同。在阳离子模式下使用常压化学电离(APCI)进行分析。除了以下参数以外如上述进行[M-H2CHH]+离子的检测:毛细管电压3200V，电晕电流4 μ Α，干燥气体流速12L分钟―1，喷雾器压力30psig，蒸发器温度350°C。通过与在50% (ν/ν)甲醇-水中制备的真实化合物的标准曲线的比较进行化合物的定量。
[0125]木质素分析
[0126]使用Soxhlet设备通过依 次用甲苯:乙醇(2:1, ν/ν)、乙醇和水提取球磨的材料来制备球磨的成熟衰老茎的不含提取物的样品(CWR) (Sluiter等，2008)。在CWR上进行使用标准克拉松方案(Dence，1992)和硫代酸解方案(Lapierre等，1995 ；1999)的木质素含量的确定。通过GC-MS以其三甲基-甲硅烷基化的衍生物鉴定木质素衍生的单体。所有的木质素分离重复进行。
[0127]总糖分析和半纤维素糖分析
[0128]对于总糖水解，球磨的成熟衰老茎(50mg)的CRW在30°C下在500 μ LH2SO4 (72%,w/v)中溶胀60分钟，并且在加入去离子水(14mL)之后在120°C下在稀H2SO4 (4%，w/v)中高压灭菌I小时。样品被冷却至室温并且用预称重的GF/C玻璃微纤维过滤器(沃特曼(Whatman))过滤。收集滤液并且在HPAEC-PAD分析之前用去离子水稀释100倍。对于半纤维素水解，在120°C下球磨的成熟干燥的茎的CRW(5mg)在Iml的2M三氟乙酸(TFA)中水解I小时。通过在真空下干燥来去除TFA并且在HPAEC-PAD分析前在去离子水(ImL)中重悬残留物。
[0129]HPAEC-PAD 分析
[0130]通过水解物质的HPAEC-PAD来确定单糖组成。在PA20柱(戴安公司(Dionex))上以0.5mL分钟―1的流速进行层析。在每个样品(20 μ L)注射之前，用200mM NaOH洗涤柱10分钟，然后用IOmM NaOH平衡10分钟。洗脱程序由第0-1.5分钟的IOmM Na0H-5mM NaOH线性梯度，然后第1.5-20分钟是用5mM NaOH等度洗脱以及第20-43分钟升高至800mM NaOH的线性梯度组成。使用按照生产商说明书使用设定在波形A上的脉冲电流分析仪(金电极)检测单糖。运行包括 L-Fuc、L-Rha、L-Ara、D-Gal、D-Glc、D-Xyl、D-GalA 和 D-GlcA(西格玛-艾尔德里奇公司)的单糖标准的校准曲线来验证相应的因子。使用AN0VA，之后徒吉检验(Tukey’ s test)来实施统计学分析。
[0131 ] FT-拉曼和FT-1R光谱分析
[0132]在来自3个独立培养物的球磨成熟衰老茎的CWR(2mg)上进行FT-拉曼光谱。用装备有1064nm 二极管激光器(Bruk`er光学产品公司(Bmoker Optics Inc.))的BmokerMultiRAM FT-拉曼系统收集拉曼光谱。每个样品获得5个光谱，光谱分辨率为4cm—1，使用50mW的激光能量和256光点(scan)来实现良好的信噪比。进行对于获得的光谱的白光校对以校正光学期间对于光谱的影响。在200-35000^1范围内的光谱是平滑的并且用OPUS软件校正基线。分别使用1555-1690CHT1和lOlO-lHScnT1范围内测量的积分强度来确定木质素和多糖(纤维素和半纤维素)含量。对于FT-1R光谱，在来自五周龄植物的茎的基底区域的50-μπι厚部分的木质部和束间纤维组织上进行分析。对于野生型和IRX5: HCHL (品系2)，分析了来自3种不同植物的5-6个部分。从对着木质部导管和束间纤维的50 μπιχ50 μ m窗口中收集FT-1R光谱，并且如上述进行数据的标准化和统计学分析(斯氏t检验)(Mouille 等，2003)。
[0133]纤维素分解的木质素(CEL)分离和尺寸排阻色谱法(SEC)
[0134]从野生型和IRX5: HCHL(品系2)植物中纯化CEL木质素。I克的球磨成熟衰老茎与50mM NaCl (30ml)混合并且在4°C下过夜孵育。在离心(2，800g，10分钟)后，依次通过用80%乙醇(3次)、丙酮(I次)、氯仿-甲醇(I: l，v/v，l次)和丙酮(I次)超声(20分钟)提取生物质。每500mg样品用PMlOO球磨机(雷太克公司)在600Am下用含有ZrO2*球轴承(IOXlOmm)的二氧化锆容器(50mL)振动对所得的CWR球磨3小时(10分钟开/10分钟关的循环)。球磨的细胞壁(490mg野生型和480mg IRX5: HCHL)被转移到离心管(50mL)中并且在30°C下在混合旋转下用粗纤维素酶(绿木酶(Cellulysin);卡巴开公司(Calbiochem) ；60mg g—1样品)在NaOAc ρΗ5.0缓冲液(30mL)中在3天内消化4次。所得的CEL用去离子水洗涤3次并且冻干过夜。野生型回收的CEL为131mg(27.3%)而IRX5: HCHL回收的为101mg(20.6% )。对于SEC分析，在分析级1-甲基-2-吡咯烷酮-DMSOd: I, ν/ν)中制备1% (w/v)CEL木质素溶液并且在40°C下超声3小时。
[0135]如其它地方所述，使用分析技术SEC UV-F和SEC UV-A来确定溶解的木质素的多分散性(George等，2011，已提交)。使用装备了 FL(G1321A)和DA(G1315D)检测器的安捷伦1200系列二元LC系统(G1312B)。通过在80°C下以0.5mL分钟―1的流速使用NMP的流动相用Mixed-D柱(5mm粒度,300mm x7.5mm内径,200-400，OOOu的线性分子量范围，聚合物实验室(Polymer Laboratories))实现分离。在300nm(UV_A)处检测从柱上洗脱的物质的吸收。激发250nm和发射450nm被用于UV-F检测。强度由面积标准化并且在用聚苯乙烯标准校正系统之后确定分子质量的估值。
[0136]细胞壁预处理和糖化
[0137]对于热水、稀释的酸或稀释的碱预处理，球磨成熟衰老茎(IOmg)分别与340 μ L的水、340 μ L 的 H2SO4(1.2%,w/v)或 340 μ L 的 NaOH(0.25%,w/v)混合，在 30°C下孵育 30 分钟并且在120°C下高压灭菌I小时。 在室温下冷却之后，用稀释的酸和稀释的碱预处理的样品分别用5N NaOH(25 μ L)和1.25NHC1 (25 μ L)中和。通过加入635 μ L的含有80g πι1四环素、5% w/w纤维素酶复合物NS50013和0.5% w/w葡糖苷酶NS50010 (诺维泽姆公司(Novozymes))的ρΗ6.2的IOOmM柠檬酸钠缓冲液引发糖化。在5(TC下振摇(800mm)孵育72小时之后，离心样品(20，000g，3分钟)并且收集10 μ L的上清用于使用DNS试验和作为标准的葡萄糖溶液的还原糖测量(Miller，1959)。
[0138]转录组研究
[0139]在含有对应于22，089个来自拟南芥的基因的24，576基因特异性标签(GST)的完整拟南芥转录组微阵列上实施微阵列分析(Crowe等,2003 ;Hilson等,2004)。分离并单独分析来自3个独立生物重复样的RNA样品。对于每个生物重复样，收集来自3个植物的主花序梗(前两个节间)的RNA。对于每次比较，对于每个生物重复样实施有荧光抑制的技术重复(例如，每次比较9个杂交)。在Cy3-dUTP或Cy5-dUTP存在下进行RNA的逆转录(帕金埃尔默生物科学产品公司(PerkinElmer-NEN Life Science Products)),并且如Lurin等(2004)所述实施载玻片的杂交和扫描。
[0140]微阵列数据的统计学分析
[0141]如前述(Gagnot等，2008)由基于染料交换的标准化(例如，4个试验，含有24，576个GST和384个对照)进行统计学分析。为了鉴定差异表达的基因，我们对log比率进行配对t测试，假定log比率的变化对于所有基因是相似的。有极端变化(太小或太大)的点被排除。通过Bonfeironi法调整原始P值，其控制误差率判断族(I类错误等于5%)以最小化在多重比较情况中的假阳性(Ge等，2003)。如前述，Bonferroni P值≤0.05的基因被认为差异表达(Gagnot等,2008)。
[0142]数据存储
[0143]来自该文的微阵 列数据按照微阵列试验标准(MIME)的最小信息被存储在GEO(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/geo/)和 CATdb(http://urgv.evry.1nra.fr/CATdb/)上。
[0144]I1.结果
[0145]在拟南芥茎中细菌HCHL酶的表达
[0146]用β -葡萄糖醛酸糖苷酶(CTS)作为报告基因来验证IRX5启动子的组织特异性活性。基本在茎的木质部导管中检测Gus活性。在长时间的孵育之后，茎束间纤维也显示出强的GUS活性，并且在幼苗、长角果、玫瑰花结和茎生叶的维管系统中观察到更中度的染色。除了花柱和花药以外，在其它器官或组织中没有观察到活性(图9)。设计编码来自荧光假单胞菌ΑΝ103的HCHL的密码子优化的序列并且克隆在IRX5启动子的下游用于拟南芥茎的木质化组织的优先表达。通过在Tl代中的RT-PCR来验证5个独立转化体的主茎中HCHL转录物的存在(图2Α)。在Τ2代中鉴定IRX5: HCHL构建体的植物纯合体，并且其用于分析茎中HCHL蛋白表达和活性。使用“常规抗体’ ’的Western印迹分析允许在5个选择的转基因品系的茎提取物中检测HCHL(图2B ;EudeS等，2010)。另外，可在这些品系的茎中检测HCHL活性，使用阿魏酰-辅酶A作为底物，范围为0.025-0.16pkat香草醛yg—1蛋白，其中在野生型植物的蛋白提取物中没有观察到可检测的活性(表1)。选择显示最高和最低水平的HCHL活性的2个转基因品系以及展示中间活性水平的2个品系用于详细分析。
[0147]IRX5: HCHL品系的生长特征和组织解剖
[0148]从早期的玫瑰花结阶段直到衰老，IRX5: HCHL植物具有与野生型视觉上相似的生长和发育 特征(图10)。然而，与对照植物相比，来自品系IRX5: HCHL(4)和IRX5: HCHL(5)的成熟衰老茎稍短(短22%和13% )并且具有较低的干重产率(降低30%和16%)，其中来自品系IRX5: HCHL(I)和IRX5: HCHL (2)的这些特征明显不同(表II)。用光学显微镜检查5周龄的IRX5: HCHL植物的茎组织。用MSule和间苯三酚-HCl试剂染色的横向茎切片，其分别是木质素中S-单元和羟基肉桂醛单元的指示，显示了转基因和野生型植物之间相似的图案(图3A和3B)。相似地，在用甲苯胺蓝O染色的茎切片中的木质素没有揭示出基因型之间的任意定量差异(图3C)。然而，在品系IRX5: HCHL(4)的一些茎切片中观察到一些塌缩的木质部结构，但是在其它品系的切片中没有(图3C)。总之，这些数据表明在IRX5: HCHL植物中木质素含量没有大幅降低。
[0149]IRX5: HCHL品系积累C6C1可溶性酚类
[0150]提取来自5周龄野生型和IRX5: HCHL植物的茎的甲醇可溶性部分并且通过LC-MS分析。聚焦在HCHL活性的直接产物的羟基苯甲醛，以及可能的衍生物如羟基苯甲酰醇和羟基苯甲酸及其葡萄糖偶联物上进行分析。在IRX5: HCHL茎可溶性提取物中检测到痕量的4-羟基苯甲醛(HBAld)、3，4-二羟基苯甲醛(3，4-DHBAld)和4-羟基苯甲酸(HBA)，但在野生型中没有(表1II)。值得注意的是，在IRX5: HCHL植物可溶性提取物中检测到大得多的量的4-羟基苯甲酸葡糖苷(HBAGlc)和4-羟基苯甲酸葡萄糖酯(HBAGE)(对于HBAGlc范围为0.48-0.57mg g<FW而对于HBAGE范围为0.96-1.65mg g<FW)，其中在野生型提取物中存在痕量的这些HBA-葡萄糖偶联物(表1II)。
[0151]考虑到其它可溶性C6C1酚类可被糖基化，实施对于该可溶部分的酸水解以从偶联的形式中释放苷元。这个过程将使得HBAGE和HBAG收集集合回归至不可检测的水平，并且同时增加样品中游离HBA的含量(表1V)。在IRX5: HCHL品系中HBA含量范围为1.59-2.49mg g^FW，其表示与野生型样品中观察值相比113-179倍的增加，并且表明在转基因品系中积累的HBA的88-94%被糖基化。除了 HBA以外，其它在酸处理的提取物中定量的C6C1酚类包括香草醛(Van)、5_羟基香草醛(50H_Van)、丁香醛(Syrald)、5_羟基香草酸(50H-VA)和丁香酸(SyrA)，这些仅仅在IRX5: HCHL提取物中被检测到，以及HBAld、3，4-DHBAld、3，4-二羟基苯甲酸(3，4-DHBA)和香草酸(VA)，与野生型相比，这些分别在IRX5: HCHL提取物中平均有14、119、1.6和40倍的更高丰度。
[0152]IRX5: HCHL品系显示出细胞壁结合C6C1酚类中的富集。
[0153]从野生型和IRX5: HCHL植物的成熟衰老茎中得到的不含提取物的细胞壁残留物(CffR)经过温和碱水解来释放松散结合的酚类。这个过程从细胞壁样品中释放一些HBAld、3，4-HBAld、Van、50H-Van、SyrAld、HBA、VA 和 SyrA，这些使用 LC-MS 分析来定量。在野生型细胞壁中未检测到的50H-Van在IRX5: HCHL样品的细胞壁中存在并且与野生型相比，在IRX5: HCHL植物的细胞壁中HBAld、SyrAlcUHBA、VA和SyrA分别平均增加约2、6、68、2和5倍(表V)。这些结果表明在IRX5: HCHL植物中较大量的C6C1酚类与细胞壁松散结合。另一方面，使用这个过程从细胞壁中释放的阿魏酸酯和香豆酸酯的量在转基因和野生型样品之间没有区别。
[0154]IRX5: HCHL植物茎的光谱分析
[0155]未显示出缺陷木质部结果并且生物质产率与野生型植物相似的品系IRX5: HCHL(2)被选择用于进一步分析。使用傅里叶变换拉曼(FT-拉曼)光谱来确定从IRX5: HCHL植物的衰老的茎中得到的CWR的化学组成。数据显示，与野生型相比，在IRX5: HCHL植物中的木质素含量和多糖(纤维素和半纤维素)的量没有显著差异(图4A)。另外，在5周龄IRX5: HCHL和野生型植物的横向茎切片的木质化组织(木质部和束间纤维)上进行傅里叶变换红外(FT-1R)光谱分析揭示了两种基因型之间的差异(图4B)。特别地，在光谱中观察到在分配给木质素的不同弯曲或拉伸的条带的显著变化(Agarwal和 Atalla, 2010, Fackl er 等，2010)。例如，在波长 1589cm 1 和 1506cm 1 (芳环拉伸)、1464cm—1 (C-H基团变形)、1425cm—1 (甲氧基C-H基团变形)、1379cm—1 (芳族骨架振动与在平面上C-H基团变形结合)和126801^1 (带有C = O基团拉伸的芳环呼吸(breathing))处的吸收在纤维中被改变，其中在条带1367(311^(甲氧基C-H基团变形)处观察到木质部细胞壁的最显著差异。总之，光谱分析表明了在表达HCHL的植物中木质素的组成修饰。
[0156]在IRX5: HCHL植物茎中单糖含量和组成
[0157]在来自品系IRX5: HCHL(2)和野生型植物的成熟衰老茎的总细胞壁多糖的硫酸水解后确定单糖组成。虽然两个基因型有相似量的总单糖，与野生型植物相比，IRX5: HCHL植物显示出在葡萄糖上的减少(-12% )以及在木糖(+22% )和阿拉伯糖(+16%)上的增加(表VI)。另外，使用三氟乙酸从CWR释放的半纤维素单糖显示与野生型相比，在这个水解中定量的糖的总量在IRX5: HCHL茎中高出23%，对应于较高的木糖(+23% )和阿拉伯糖含量(+22% )(表VI)。
[0158]纳入到IRX5: HCHL植物的木质素的非常见C6C1单体
[0159]在CWR上确定在来自野生型和IRX5: HCHL(2)植物的成熟衰老茎的木质素含量和单体组成。在两个独立的培养 中，克拉松木质素(KL)是相同的并且对于野生型和IRX5: HCHL植物占CWR约20% (表VII)。通过硫代酸解，一种从包含在不稳定连接β _0_4键中的木质素单元中产生巯乙酸化(thioethylated)单体的化学降解方法来评价木质素单体组成。数据显示与野生型相比，在硫代酸解之后在两个独立培养的IRX5: HCHL植物中从CWR释放的常规H、G和S单体的总量(或总产率)减少25%和16%，表明在转基因中这三种单体木质醇中较少地以β-0-4键交联(表VII)。考虑到野生型和IRX5: HCHLCffR的相同KL值，这些数据表明在转基因植物中木质素单体之间较高频率的硫代酸解耐受性键。从该木质素部分中回收的G和S单元的相对量没有变化，野生型和转基因样品显示出0.34-0.36的S/G，然而，在IRX5: HCHL植物中H单元的摩尔频率明显更高(表VII)。此外，与野生型植物相比，在IRX5: HCHL植物中由硫代酸解释放的非常规单元如VaruSyrald和SyrA分别显示平均1.44,2.08和1.65倍的增加。有趣的是，从转基因植物的木质素中释放出两种新的木质素单元，其被鉴定为C6C1香草醇(Vanalc)和丁香醇(Syralc)(表VIII)。另一方面，在两种基因型之间松柏醛端基(Cald)和VA不变(表VIII)。总之，这些数据显示与野生型相比，通过硫代酸解从IRX5: HCHL茎细胞壁释放的单体之间较高量的C6C1苯酚端基。
[0160]IRX5: HCHL植物的木质素具有降低的分子量
[0161]用尺寸排阻色谱法(SEC)确定从野生型和IRX5: HCHL(2)茎中纯化的细胞裂解木质素多分散性。通过监测溶解的木质素的UV-A吸收(SEC UV-A3J和UV-F荧光(SECUV-Fex250/em450)得到的洗脱曲线揭示出野生型和IRX5: HCHL植物之间的差异(图6)。首先，由于在7分钟和9分钟之间洗脱的最大木质素部分的明显损失，在转基因中对应在7分钟和13.5分钟之间的最大质量峰严重降低。相似地，之后洗脱的在13.5分钟和19.5分钟之间的第二峰中的较小分子量材料在IRX5: HCHL样品中更丰富(使用UV-A和UV-F监测增加27%和16% )。最后，使用UV-F在19.5分钟和26.5分钟之间检测到的最小木质素部分的量在转基因中增加55% (图6)。这些结果证明在从IRX5: HCHL植物中纯化的木质素中较小的链和降低的聚合度。
[0162]IRX5: HCHL品系显示增加的糖化效率
[0163]为了检测由在木质化组织中HCHL酶的表达造成的木质素尺寸降低对于细胞壁可消化性的影响，对衍生自用热水、稀释的碱和稀释的酸预处理的成熟衰老茎的生物质进行糖化试验。在用纤维素酶和葡糖苷酶孵育72小时之后，与野生型相比，预处理的IRX5: HCHL植物的生物质释放更多的还原糖(图7)。具体地，不同IRX5: HCHL品系观察到的糖化效率的改善在热水后范围为34% -77%，在稀释的碱后为43% -71%并且在稀释的酸预处理后为15% -31% (图7)。
[0164]III.讨论
[0165]在植物中HCHL的表达原先被认为在植物体内产生有价值的和溶解性的化合物如Van和HBA。然而，由于强的异位HCHL表达，在转基因烟草和甘蔗中观察到相反的表型如萎黄和衰老的叶、矮小、低划分产生、雄性不育、塌缩的木质部导管以及生物质的减少(Mayer等，2001 ；Merali等，2007 ;McQualter等，2005)。在这个研究中，发明人选择次生细胞壁纤维素合成酶的启动子来在拟南芥茎的木质化组织中优选表达HCHL(图9)。成功地，由IRX5: HCHL构建体转化的植物不是矮化的或不育的，并且幼玫瑰花结叶没有显示出降低的表皮荧光，其为苯丙素-衍生的可溶性酚类集合中改变的征兆。虽然两个IRX5: HCHL品系显示减少的生物质，并 且在一种当中，显示由较强HCHL活性和细胞壁完整性的可能修饰造成的一些偶发的塌缩的木质部导管，但是一些其它IRX5: HCHL品系与野生型植物的相当的。
[0166]正如期望的，转基因品系显示增加量的可溶性C6C1醛(HBAld、3，4_DHBAld和Van)，其在羟基苯甲酰-辅酶A、3，4- 二羟基苯甲酰-辅酶A和阿魏酰-辅酶A切割之后由HCHL活性产生。HCHL没有针对芥子(sinapoyl)-辅酶A的活性，这表明Syrald是Van的转化产物，其得到新的中间体50H-Van的鉴定的支持(Mitra等，1999 ;图11)。相似地，本文所示的数据不能排除在苯环的C-3位置上依次羟基化和甲氧基化之后，3，4-DHBald和Van中的一些在衍生自HBAld的转基因品系中积累。有趣的是，编码单加氧酶的集中基因在表达HCHL的植物中被上调，但是没有已知或预测的O-甲基转移酶显示改变表达水平(表1X )。在转基因品系中可溶性芳族的分析也显示C6-C1醛被氧化为它们相应的酸的形式。这种转化可能是对于减少这些化学反应性化合物的量的响应，由于来自短链脱氢酶/还原酶(SDR)、醛酮还原酶(AKR)和醛脱氢酶(ALDH)家族的几个基因在表达HCHL的植物中被上调(图11 ;Kirch等，2004 ;Kavanagh等，2008)。具体地，AKR4C9 (At3g37770)编码已知代谢一类羟基苯甲醛的酶(Simpson等，2009)。另外，可溶性C6C1酚类主要以偶联物的形式在转基因品系中积累，由于我们显示葡萄糖偶联物(酚基葡糖苷和葡萄糖酯)占HBA可溶性集合的约90%，大概是由于如前述的其它C6C1酚类的液泡储存(Eudes等，2008)。这种C6C1酸葡糖苷积累与在表达HCHL的烟草、甜菜、曼陀罗和甘蔗植物中所观察到的相符(Mayer等，2001 ；Mitra等，2002 ；McQualter等，2005 ；Rahman等，2009)。有趣的是，HCHL植物的表达分析揭示了Μ)Ρ-葡糖基转移酶(UGT)家族的7个上调的基因并且在它们当中UGT75B1和UGT73B4之前显示催化葡萄糖酯化和苯甲酸酯的酚基葡糖基化(表1X ；Lim等，2002 ；Eudes等，2008)。
[0167]另外，该研究显示在温和碱水解时从衰老茎的不含提取物的细胞壁部分中释放出一些C6C1酚类。与野生型相比，在IRX5: HCHL品系的“松散细胞壁-结合’’部分中测量到较高量的HBAld、50H-Van、SyrAld、HBA、VA和SyrA。虽然，涉及的连接的类型还未清楚，先从拟南芥叶和根的细胞壁中提取松散连接的C6C1酚类(Tan等，2004 ；Forcat等，2010)。
[0168]来自表达HCHL的植物的木质素显示增加的C6C1酚类的含量。值得注意的是，对于在硫代酸解后释放的木质素单体的分析`鉴定出两种新型单元(Vanalc和Syralc)并且显示出大量的SyralcUVan和SyrA。这表示部分的C6C1醛被转化为醇和酸并且证明在木质素中它们以β-0-4-连接的C6C1单体端基被纳入到木质素中(图11)。由于缺少苯丙素端尾，当纳入到木质素末端链中时这些新的单体木质醇应阻碍聚合物的进一步聚合并且作用为缩合终止子或终止剂分子。有趣的是，转基因植物也显示出较高含量的常规H-单元(+30%)，其优选分布为木质素中的端基并且在成木质素尺寸和结构的改变(Lapierre, 2010 ；Ziebell等，2010)。另外，过量产生C6C1单体木质醇并且具有与野生型植物相似的木质素含量的植物显示出较低的硫代酸解释放的单体木质醇，表明用于聚合物延伸的在木质素末端链中自由苯丙素端尾的可及性的降低。也表明较高的碳-碳连接和增加的木质素缩合度。
[0169]假定在木质素中端基单元的较高纳入会阻碍更常见的链延伸并且最终降低木质素支化和聚合度。这种假设进一步得到在过量产生这些“终止剂’’分子的植物中木质素多分散性的分析的支持，其显示高分子量的明显降低和低分子量的明显增加，因此支持较小的木质素链长度。这些观察对于理解来自HCHL品系的生物质对于多糖酶促水解的较高易感性是相关的。虽然，通过细胞壁的几个特征确定生物质的糖化效率，在不同的预处理后观察到的糖化效率的改善表明较低分叉的木质素会减少细胞壁多糖(纤维素和半纤维素)的交联和包埋并且有利于它们与水解酶的可及性。这个假设由以下实施支持，即在过量产生这些C6C1单体的植物的细胞壁中总糖含量不变。
[0170]可推测出在植物体内能使用木质化“终止剂’ ’分子的过量表达来修饰木质素结果以减少木质纤维素生物是的顽固性。由于这个方法不需要任意特定的遗传背景，其应易于转化到各种能源作物中。限制这些木质化“终止剂’’分子在支承木质化组织(例如，厚壁组织(schlerenchyma)纤维)中的生物合成并且避免在传导组织(例如，导管)中强产生应该限制了对植物发育和生物质产生不利影响的风险。
[0171]实施例2:在水稻中细菌HCHL的表达
[0172]这个例子说明在单子叶植物，水稻中细菌HCHL的表达。用实施例1所述的DNA构建体转化水稻植物。水稻品系经过人工改造(图12)表达HCHL基因，如RT-PCR所证明(图13)。另外，水稻品系的评价证明它们积累PHBA(对羟基苯甲酸酯)(图14)，其由HCHL从对-香豆酰-辅酶A的转化中产生。
[0173]这个实验还证明来自双子叶植物的次生细胞壁启动子pIRX5(在这个实施例中为拟南芥)能够用于单子叶植物(在这个实施例中为水稻)。
[0174]应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。通过引用将本文引用的所有发表物、专利、登录号和专利申请全部纳入本文用于所有目的。
[0175]参考文献
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[0266]说明性序列
[0267]SEQ ID NO:1
[0268]荧光假单胞菌HCHL的氨基酸序列(GenBank登录号CAA73502)
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[0271]编码SEQ ID NO:1的多核苷酸序列(由GenScript进行密码子优化)
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[0274]含有IRX5启动子(pIRX5)的多核苷酸序列
[0275]ATGAAGCCATCCTCTACCTCGGAAAAACTTGTTGCGAGAAGAAGACATGCGATGGCATGGATGCTTGGATCTTTGACATTGATGACACTCTTCTCTCAACCATTCCTTACCACAAGAGCAACGGTTGTTTCGGGTAAATAAACTAAACTTAACCATATACATTAGCCTTGATTCGGTTTTTGGTTTGATTTATGGATATTAAAGATCCGAATTATATTTGAACAAAAAAAAATGATTATGTCACATAAAAAAAAATTGGCTTGAATTTTGGTTTAGATGGGTTTAAATGTCTACCTCTAATCATTTCATTTGTTTTCTGGTTAGCTTTAATTCGGTTTAGAATGAAACCGGGATTGACATGTTACATTGATTTGAAACAGTGGTGAGCAACTGAACACGACCAAGTTCGAGGAATGGCAAAATTCGGGCAAGGCACCAGCGGTTCCACACATGGTGAAGTTGTACCATGAGATCAGAGAGAGAGGTTTCAAGATCTTTTTGATCTCTTCTCGTAAAGAGTATCTCAGATCTGCCACCGTCGAAAATCTTATTGAAGCCGGTTACCACAGCTGGTCTAACCTCCTTCTGAGGTTCGAATCATATTTAATAACCGCATTAAACCGAAATTTAAATTCTAATTTCACCAAATCAAAAAGTAAAACTAGAACACTTCAGATAAATTTTGTCGTTCTGTTGACTTCATTTATTCTCTAAACACAAAGAACTATAGACCATAATCGAAATAAAAACCCTAAAAACCAAATTTATCTATTTAAAACAAACATTAGCTATTTGAGTTTCTTTTAGGTAAGTTATTTAAGGTTTTGGAGACTTTAAGATGTTTTCAGCATTTATGGTTGTGTCATTAATTTGTTTAGTTTAGTAAAGAAAGAAAAGATAGTAATTAAAGAGTTGGTTGTGAAATCATATTTAAAACATTAATAGGTATTTATGTCTAATTTGGGGACAAAATAGTGGAATTCTTTATCATATCTAGCTAGTTCTTATCGAGTTTGAACTCGGGTTATGATTATGTTACATGCATTGGTCCATATAAATCTATGAGCAATCAATATAATTCGAGCATTTTGGTATAACATAATGAGCCAAGTATAACAAAAGTATCAAACCTATGCAGGGGAGAAGATGATGAAAAGAAGAGTGTGAGCCAATACAAAGCAGATTTGAGGACATGGCTTACAAGTCTTGGGTACAGAGTTTGGGGAGTGATGGGTGCACAATGGAACAGCTTCTCTGGTTGTCCAGTTCCCAAGAGAACCTTCAAGCTCCCTAACTCCATCTACTATGTCGCCTGATTAAATCTTATTTACTAACAAAACAATAAGATCAGAGTTTCATTCTGATTCTTGAGTCTTTTTTTTCTCTCTCCCTCTTTTCATTTCTGGTTTATATAACCAATT`CAAATGCTTATGATCCATGCATGAACCATGATCATCTTTGTGTTTTTTTTTCCTTCTGTATTACCATTTTGGGCCTTTGTGAAATTGATTTTGGGCTTTTGTTATATAATCTCCTCTTTCTCTTTCTCTACCTGATTGGATTCAAGAACATAGCCAGATTTGGTAAAGTTTATAAGATACAAAATATTAAGTAAGACTAAAGTAGAAATACATAATAACTTGAAAGCTACTCTAAGTTATACAAATTCTAAAGAACTCAAAAGAATAACAAACAGTAGAAGTTGGAAGCTCAAGCAATTAAATTATATAAAAACACTAACTACACTGAGCTGTCTCCTTCTTCCACCAAATCTTGTTGCTGTCTCTTGAAGCTTTCTTATGACACAAACCTTAGACCCAATTTCACTCACAGTTTGGTACAACCTCAGTTTTCTTCACAACAAATTCAAACATCTTACCCTTATATTACCTCTTTATCTCTTCAATCATCAAAACACATAGTCACATACATTTCTCTACCCCACCTTCTGCTCTGCTTCCGAGAGCTCAGTGTACCTCGCC
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[0278]MTATEATLPANDPDLS⑶NVAVAFEDGIAWVKLNRPEKRNAMSVSLAEDMNVVLDKLEIDDRCGVLVLTGEGSAFSAGMDLKDFFRATDGVSDVERMRAYRSTRAWQWRTLMHYSKPTIAMVNGWCFGGAFTPLICCDLAISSDDAVYGLSEINWGIIPGGVVSKAISTLMSDRQALYYVMTGEQFGGQEAVKLGLVNESVPADKLRERTVELCKVLLEKNPTTMRQARMAYKYIREMTffEESAEYLTAKGDQTVFVDKEKGREQGLKQFLDDKTYRPGLGAYKR
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[0281]MSTPTTDPGTTTTPWGDTVLVDFDDGIAWVTLNRPEKRNAMNPAMNDEMVRTLDALEADPRCRVMVLTGAGESFSAGMDLKEYFREVDQTADPSVQIRVRRASAEWQWKRLAHWSKPTIAMVNGWCFGGAFTPLVACDLAISDEEARYGLSEINWGIPPGGVVSRALAAAVSQRDALYFIMTGETFDGRRAEGMRLVNEAVPAERLRERTRELALKLASTNPVVLRAAKVGYKIAREMPWEQAEDYLYAKLEQSQFLDAERGREKGMAQFLDDKSYRPGLSAYSTD
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[0285]SEQ ID NO:7
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[0287]MATYEGRffNTVKVDVEDGIAWVTLNRPDKRNAMSPTLNREMIDVLETLELDGDAQVLVLTGAGESWSAGMDLKEYFRETDGQPEMQERIRRDCSQWQWKLLRFYSKPTIAMVNGWCFGGAFSPLVACDLAIAADDAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAVADTMGHRAALHYIMTGETFTGREAAEMGLVNRSVPRERLREAVTELAGKLLAKNPVVLRYAKHGFKRCRELSWEQNEDYLYAKVDQSNHRDPEKGRQHGLKQFLDDKTIKPGLQTYKRA
[0288]SEQ ID NO:8
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[0290]MSNYQDRWQTVQVQIDAGVAWVTLNRPEKRNAMSPTLNREMIDVLETLELDSAAEVLVLTGAGESWSAGMDLKEYFREIDGKEEIVQERMRRDCSQWQWRLLRFYSKPTIAAVNGWCFGGAFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAVADTMGHRNAMLYIMTGRTFTGTEAAQMGLVNASVPRAQLRAEVTKLAQELQQKNPVVLRFAKHGFKRCRELTffEQNEDYLYAKVDQSNHRDPEKGRQQGLKQFLDDKTIKPGLQTYKR
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[0300]SEQ ID NO: 12
[0301]新洋葱伯克霍尔德氏菌_AU_1054_ZP_04942909 (氨基酸序列)[0302]MSKYDNRWQTVEVKVEAGIAWVTLNRPEKRNAMSPTLNREMLEVLDAVEFDDEAKVLVLTGAGAAffTAGMDLKEYFREIDGGSDALQEKVRRDASEWQWRRLRMYNKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADDAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRRALHYIMTGDTFTGAEAAEMGLVNSSVPLAELRDATIALAARLMDKNPVVLRAAKHGFKRSRELTffEQCEDYLYAKLDQAQLRDPERGREQGLKQFLDDKTIKPGLQAYKR
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[0304]不明确伯克霍尔德氏菌_MC40_6_YP_776799 (氨基酸序列)
[0305]MSKYDNRWQTVEVNVEAGIAWVTLNRPDKRNAMSPTLNQEMLQVLDAIEFDDDAKVLVLTGAGSAWTAGMDLKEYFREIDGGSDALQEKVRRDASEWQWRRLRMYNKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRRALHYIMTGDTFTGVEAAEMGLVNSSVPLAGLRDATIALAARLMDKNPVVLRAAKHGFKRSRELTffEQCEDYLYAKLDQAQLRDPERGREQGLKQFLDDKAIKPGLQAYKR
[0306]SEQ ID NO:14
[0307]洋葱伯克霍尔德氏菌_AMMD_YP_776799 (氨基酸序列)
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[0309]SEQ ID NO: 15 [0310]泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderiathailandensis)_MSMB43_ZP_02468311 (氨基酸序列)
[0311 ] MSKYDNRWQTVEVKVEAGIAWVTLNRPDKRNAMSPTLNQEMLQVLDAIEFDDDAKVLVLTGAGTAWTAGMDLKEYFREIDGGPDALQEKVRRDASEWQWRRLRMYGKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRCALHYIMTGDTFTGVEAADMGLVNRSVPLAELRDATIALAARLIDKNPVVLRAAKHGFKRSRELTffEQCEDYLYAKLDQAQLRDPERGREQGLKQFLDDKAIKPGLQAYKR
[0312]SEQ ID NO: 16
[0313]尤伯纳伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaubonensis)_Bu_ZP_02382374(氨基酸序列)
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[0315]SEQ ID NO: 17
[0316]维涅兰德固氮菌_Av0P_YP_002798614 (氨基酸序列)
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[0318]SEQ ID NO: 18
[0319]恶臭假单胞菌_KT2440_NP_745498 (氨基酸序列)
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[0325]丁香假单胞菌_NP_792742 (氨基酸序列)
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[0327]SEQ ID NO:21
[0328]罗氏真养菌(Ralstoniaeutropha)_JMP 134—YP_299062 (氨基酸序列)`[0329]MANYEGRWKTVKVSVEEGIAWVMFNRPEKRNAMSPTLNSEMIQVLEALELDADARVVVLTGAGDAWTAGMDLKEYFREVDAGPEILQEKIRRDACQWQWKLLRMYAKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQALHYMTCDTFTGQQAAAMGLVNKSVPRSQLREHVLELAGKLLEKNPVVLRAAKHGFKRSRELTffEQNEDYLYAKLDQAQLRDPEHGREQGLKQFLDDKSIKPGLQAYKRA
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[0331]荚壳伯克霍尔德氏菌_BGR1—YP_002908688 (氨基酸序列)
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[0333]SEQ ID NO:23
[0334]植物令伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaphytofirmans)_PsJN_YP_001887778 (氨基酸序列)
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[0337]鼻疽伯克霍尔德氏菌_ATCC_23344—YP_105383 (氨基酸序列)
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[0339]SEQ ID NO:25
[0340]类鼻疽伯克霍尔德氏菌_Pasteur_ZP_01765668 (氨基酸序列)
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[0342]SEQ ID NO:26
[0343]多噬伯克霍尔德氏菌_ATCC_17616—YP_001583186(氨基酸序列)
[0344]MSYEGRWKTVKVAVEGGIAWVTLNRPEKRNAMSPTLNAEMIDVLEAIELDPEAQVLVLTGE⑶AWTAGMDLKEYFREVDAGPEILQEKIRRDASRWQWQLLRMYAKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQALYYMTCDTFTGQQAAQMGLVNKSVPRAQLRDEVRALAAKLLDKNPVVIRNAKHGFKRCRELTffEQNEDYLYAKLDQANYRDPEGGREQGLKQFLDEKSIKPGLQAYKR
[0345]SEQ ID NO:27
[0346]越南伯克霍尔德氏菌_G4_YP_001116289(氨基酸序列)
[0347]MGYEGRWKTVK VEVAGGIAWVTLNRPEKRNAMSPTLNTEMIDVLEAIELDADAQVLVLTGE⑶AWTAGMDLKEYFREIDAGPEILQEKIRRDASRWQWQLLRMYAKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHREALYYMTCDTFTGQQAARMGLVNKSVPRAQLRDEVRALAAKLLDKNPVVIRNAKHGFKRCRELTffEQNEDYLYAKLDQANYRDPEGGREQGLKQFLDDKSIKPGLQAYKR
[0348]SEQ ID NO:28
[0349]鞘脂单胞杆菌(Sphingobiumjaponicum)_UT26s_YP_003543683 (氨基酸序列)
[0350]MSEYLTEGPDLSRTCVDVMFDEGIAWVTLNRPEKRNAMSPTLNSEMLAILEQLELDPRCGVVVLTGAGDSFSAGMDLKEYFRETDGLPPAQVRRIRQTAQAWQWRTLQHFGKPTIAMVNGWCFGGAFTPLVACDLAIAANEAVFGLSEINWGIIPGGNVTKAIQERLRPQDAALYIMTGRNFTGEKAAQMGLVAEAVPLTDLRDHTRALALELLSKNPVVLNAAKIALKKVADMTWDVAEDYLVAKGAQTRVADKTDGRNKGITQFLDEKSYKPGLEGYRRDK
[0351]SEQ ID NO:29
[0352]地毯草黄单胞菌_NP_641235 (氨基酸序列)
[0353]MNEHDVVSVRIENRIAWVKFARPDKRNAMSPALNRRMMDVLDELEFDDNVGVLVLGGEGTAWSAGMDLKEYFRETEAQGLRGVRRSQRESYGWFRRLRWYQKPTIAMVNGWCFGGGFGPLFACDLAIAADEAQFGLSEINWGILPGGGVTKVAVELLSMRDAMWMTLTGEMVDGKKAAEWRLVNESVPLERLEARTREVAELLLRKNPVALKYAKDAVRRVGTMTYDEAEDYLVRMQEAANSFDNNARKEGIRQFIDEKSYKPGLGEYDLSKHSA
[0354]SEQ ID NO:30
[0355]野油菜黄单胞菌_ATCC_33913_NP_636201 (氨基酸序列)
[0356]MNEHDVVSVHVENRIAWVKFARPDKRNAMSPALNRRMLDVLDELEFDDNVGVLVLGGEGTAWSAGMDLKEYFRETEAQGLRGVRRSQRESYGWFRRLRWYQKPTIAMVNGWCFGGGFGPLFACDLAIAADEAQFGLSEINWGILPGGGVTKVAVELLSMRDAMWMTLTGELVDGRKAAEWRLVNESVPLERLETRTREVAELLLKKNPVALKYAKDAVRRVGTMTYDEAEDYLVRMQEAANSFDNNARKEGIRQFIDEKRYKPGLGAYEPDAGTN
[0357]SEQ ID NO:31
[0358]固氮螺菌属_B510_YP_003451575 (氨基酸序列)[0359]MTQQQAAARTGTAEDVVTVELDNGVAWVTLNRPDKRNAMNPALNARMHGVLDDLEVDDRCQVLVLTGAGESFSAGMDLKEYFRETEAKGHMATRRAQRDSYGWWRRLRWFEKPSIAMVNGWCFGGAFSPLFACDLAVAADEAQFGLSEINWGIIPGGNVTKVVADLMS QREAMYYILTGETFDGRKAAEMKLVNFSVPHAELRAKVRAIADNLLEKNPQTLKAAKDAFKRVVEMPFDAAEDYLVVRQESLNYLDKSEGRKQGIKQFIDDKTYRPGLGAYKR
[0360]SEQ ID NO:32
[0361 ] 葡萄土壤杆菌_S4_YP_002549228 (氨基酸序列)
[0362]MTVAEKSDADTVLVDIEDRIAFVTFNRPEKRNAMNPALNIRMAEVLEELEADDRCGVLVLRGAGTSWSAGMDLQQYFRDNDDKPRHATLKSRRQSGGWWQRLTYFEKPTIAMVNGWCFGGAFNPLVACDLAIAANEATFGLSEINWGILPGGNVTRAVAEVMNHRDSLYYIMTGEPFGGEKARDMGLVNESVPLEELETRVRKLCASLLEKNPVTMKAAKDTFKRVRNMPffELADDYIYAKLEQMLLLDKTRGRDEGLKQFLDDKTYRPGLGAYKRK
[0363]SEQ ID NO:33
[0364]埃特里根瘤菌巴西变种(Rhizobiumetli Brasil)_5_YP_001985541 (氨基酸序列)
[0365]MTENTSPVLVEFDGGIAFVTLNRPEKRNAMNPALNARMLEVLDELE⑶ERCGVLVLRGAGQSWSAGMDLKEYFRDNDDKPRDATLKARRQSGGWWGRLMYFEKPTIAMVNGWCFGGAFTPLVSCDLAIAAEEANFGLSEINWGILPGGNVTRAVAEVMRHRDALYYIMTGELFGGRKAAEMGLVNEAVPLVDLETRVRKICASLLEKNPVTLKAAKDTYKRVRNLPffDLADDYIYAKLEQMLFLDKTKGRDEGLKQFLDDKTYQPGLGAYKRGR
[0366]SEQ ID NO:34
[0367]豌豆根瘤菌三叶草生物变种_WSM1325_YP_002973001 (氨基酸序列)
[0368]MTEDKSPVLVEFDSGIAFVTLNRPEKRNAMNPALNIRMLEVLDELE⑶ERCGVLVLRGAGESWSAGMDLKEYFRDNDDKPRDVTLKARRQSGNWWGRLMYFEKPTIAMVNGWCFGGAFTPLVSCDLAIMEEANFGLSEINWGILPGGNVTRAVAEVMRHRDALYYIMTGELFGGRKAAEMGLVNEAVPLAELEPRVRKICASLLEKNPVTLKAAKDTYKRVRNLPffDLADDYIYAKLEQMLFLDKTKGRDEGLKQFLDDKTYQPGLGAYKRGR
[0369]SEQ ID NO:35
[0370]IRx5 的氨基酸序列(GenBank 登录号 AF458083_1)
[0371]mepntmasfddehrhssfsakickvcgdevkdddngqtfvachvcvypvckpcyeyersngnkccpqcntlykrhkgspkiagdeenngpddsddelnikyrqdgssihqnfaygsengdynskqqcrpngrafsstgsvlgkdfeaerdgytdaewkervdkwkarqekrglvtkgeqtnedkeddeeeeIldaearqplwrkvpissskispyrivivlrIvilvfffrfriltpakdayplwlisviceiwfalswildqfpkwfpinretyIdrlsmrferdgeknklapvdvfvstvdplkeppiitantiI silavdypvnkvscyvsddgasmlIfdtlsetsefarrwvpfckkynveprapefyfsekidylkdkvqttfvkdrramkreyeefkvrinalvakaqkkpeegwvmqdgtpwpgnntrdhpgmiqvylgkegafdidgneIprlvyvsrekrpgyahhkkagamnamvrvsavltnapfmlnldcdhyinnskairesmcflmdpqlgkklcyvqfpqrfdgidhndryanrnivffdinmrgldgiqgpvyvgtgcvfnrpalygyeppvsekrkkmtcdcwpswiccccgggnrnhhkskssdssskkksgiksllsklkkknkkksddktmssysrkrsateaifdledieeglegydeleksslmsqknfekrfgmspvfiastlmengglpeatntsslikeaihviscgyeektewgkeigwiygsvtediltgfrmhcrgwksvycmpkrpafkgsapinlsdrlhqvlrwalgsveiffsrhcplwyawggklkilerlayintivypftsipllayctipavclltg kfiiptinnfasiwflalflsiiatailelrwsgvsindlwrneqfwviggvsahlfavfqgllkvlfgvdtnftvtskgasdeadefgdlylfkwttllippttliilnmvgvvagvsdainngygswgplfgklffafwvivhlypflkglmgrqnrtptivvlwsillasifslvwvridpflpkqtgpllkqcgvdc
【权利要求】
1.一种包括与启动子可操作地连接的异源羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL)的工程改造的植物。
2.如权利要求1所述的工程改造的植物，其特征在于，所述启动子是次生细胞壁特异性启动子。
3.如权利要求2所述的工程改造的植物，其特征在于，所述次生细胞壁特异性启动子是IRX5启动子。
4.如权利要求1、2或3所述的工程改造的植物，其特征在于，所述HCHL是荧光假单胞菌 HCHL。
5.如权利要求1、2或3所述的工程改造的植物，其特征在于，所述植物是单子叶植物。
6.如权利要求1、2或3所述的工程改造的植物，其特征在于，所述植物是双子叶植物。
7.如权利要求1、2或3所述的工程改造的植物，其特征在于，所述植物选自拟南芥、杨树、桉树、7K稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒、甘鹿、松树、苜猜、小麦、大豆、大麦、草皮草、烟草、大麻、竹子、油菜、向日葵、柳树和短柄草。
8.一种来自权利要求1-7中任一项的植物细胞。
9.来自权利要求1-7中任一项所述的植物的部分。
10.来自权利要求1-7中任一项所述的植物的种子、花、叶或果实。
11.包括权利要求1-7中任一项所述的植物或权利要求1-7中任一项所述的植物的部分的生物质。·
12.一种包括编码羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL)和异源启动子的多核苷酸的分离的表达盒，所述启动子可操作地与所述多核苷酸序列连接，其中所述启动子是次生细胞壁特异性启动子。
13.如权利要求12所述的表达盒，其特征在于，所述HCHL是荧光假单胞菌HCHL。
14.如权利要求12或13所述的表达盒，其特征在于，所述启动子是IRX5启动子。
15.包含权利要求12-14中任一项所述表达盒的植物细胞。
16.一种工程改造具有降低木质化的植物的方法，所述方法包含: (1)将编码羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL)的多核苷酸导入植物中，其中在所述植物中的所述多核苷酸与启动子可操作地连接；以及 (2)在所述HCHL表达的条件下培养所述植物，从而降低所述植物中的木质化。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述启动子对于所述植物是异源的。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述启动子对于所述植物是内源的。
19.如权利要求16、17或18所述的方法，其特征在于，所述启动子是次生细胞壁特异性启动子。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述次生细胞壁特异性启动子是IRX5启动子。
21.如权利要求16-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述HCHL是荧光假单胞菌HCHL。
22.如权利要求16-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物是单子叶植物。
23.如权利要求16-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物是双子叶植物。
24.如权利要求16-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物选自拟南芥、杨树、桉树、7jC稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒、甘蔗、松树、苜蓿、小麦、大豆、大麦、草皮草、烟草、大麻、竹子、油菜、向日葵、柳树和短柄草。
25.一种得到可溶性糖的方法，所述方法包含将权利要求11所述的生物质在糖化反应中孵 育。
【文档编号】A01H5/00GK103827299SQ201280044622
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年7月13日 优先权日:2011年7月13日
【发明者】D·洛克, A·G·尤德斯 申请人:加利福尼亚大学董事会