用于分析大型植物群体中母体dna的方法

用于分析大型植物群体中母体dna的方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于分析种子的母体DNA的非破坏性方法。在该方法中，所述DNA从种皮表面脱落并可用于收集关于种子的母体亲本的基因组的信息。另外，本发明提供了一种用于大型植物群体的高通量DNA分析系统。
【专利说明】用于分析大型植物群体中母体DNA的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及一种用于分析种子的母体DNA的方法，W及所述方法的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 植物育种化reeding)依赖于存在于具体作物物种生殖质中的遗传变异的有效开 发，并且所述遗传变异决定了植物在特定环境的表型。传统上该是通过在表型水平观察到 的所期望的性状组合的选择来实现的，但该可W逐渐通过基于在遗传上与促成特异性状表 达的基因的等位基因型紧密连锁的分子标记的选择来进行。
[0004] 对于W隐性性状方式表现自身的性状，表型水平的性状的选择是复杂的。当亲本 之一对于一个给定的基因具有一个隐性和一个显性等位基因，并且另一个亲本对于同一基 因具有两个显性等位基因时，该两个亲本杂交的结果会是该样的群体，其中一在不存在 分离异常（segregationdistcxrtion)的情况下-一半的个体携带该基因的一个隐性等 位基因。然而，该些个体无法被识别，因为所期望的隐性性状不会在杂合子的情况下表达自 己。只有在自交并在下一代中分析子代才能确定哪个个体携带隐性等位基因，并因而确定 哪个个体是杂合的。
[0005] 通常，植物育种者或研究者希望通过尽可能早地在植物群体中鉴定感兴趣的等位 基因来尽可能快地进行工作。在许多情况下，确定产生特定种子的母本植物的遗传组成是 特别有意义的。因此，本发明的一个目的是提供一种检查种子的母体亲本的基因组的有效 和非破坏性的方法。
[0006] 在导致本发明的研究中，令人梅讶地发现，少量DNA存在于种皮表面，并且该DNA 与产生该种子的母体亲本的DNA是相同的。该DNA可W通过将种子接触流体而从种皮表面 脱落，随后该流体包含脱落的DNA，其可采用灵敏的分子生物学分析技术针对例如特定分子 标记进行分析。重要的是，该方法是非破坏性的，因为在已经接触流体之后可W将种子干 燥，并且胆存而不损失萌发能力和活力。因此，该方法允许种子的母体亲本的遗传学和分子 生物学分析，而不损伤种子或削弱其萌发能力。
[0007] 因此，本发明涉及一种用于分析种子的母体DNA的非破坏性方法，包括W下步骤： 将种子与流体接触W从种皮表面脱落DNA，并分析从所述种皮表面脱落的DNA。
[0008] 分析DNA的技术正发展得非常迅速，并且它们正变得愈发有效和灵敏。该些高度 灵敏的DNA分析方法仅要求非常少量的DNAW产生可靠的信号。导致本发明的该研究证实 该种少但可检测量的DNA位于种皮表面。
[0009] 种皮由退化的胚珠珠被（其为母体组织）发育而来。二倍体植物的种皮的倍性为 2n，在遗传上它与种子的母体亲本相同，即种子发生和发育的那个亲本。
[0010] 现有技术中存在各种用于分析来自植物或种子的DNA的技术。它们彼此主要区别 在于收集生物材料的方式，为此所用的是何种组织或植物器官，W及进行取样的是哪个发 育阶段。在商业环境中，在不必在其整个生命周期中种植植物W产生下一代的种子，或优选 甚至根本无需萌发种子并种植植物的情况下获得遗传材料用于分析（例如通过分子标记 分析或DNA测序的方式）是有利的。因此，人们希望从非常早的发育阶段收集DNA，而不危 害幼苗（plantlet)的存活和正常的进一步发育。
[0011] 传统上想要从种子获得遗传信息，要么种子不得不被破坏（destroyed)、被损伤 (damaged),要么种植成植物，其后种子或植物组织可W用于DNA提取。但是，本发明提供了 一种从种皮获得DNA的非破坏性和非侵入性的方法，其中可W收集关于该种子的母体亲本 的遗传信息，而不削弱种子萌发并发育成下一代植物的能力。
[0012] 传统上萌发种子并种植成苗，随后在允许收获足够大的组织片段而不会对幼苗导 致严重伤害的发育阶段收集苗的组织。DNA提取后，通过利用分子标记进行所期望的个体的 鉴定。基于它们缺乏一个或多个特定分子标记，剩余的植物（其可能代表取样群体的非常 大的部分）被育种者相对他的有针对性的目的而鉴定为不期望的植物。该些不期望的植物 将会被丢弃，仅仅因为它们在种植设备中占用了宝贵的空间。
[0013] 用于从幼苗获得DNA的另一种方法包括从萌发的种子收集分离的根边缘细胞（欧 洲专利申请EP-1984496)。因为不需要植物组织，基本上不存在对幼苗的损伤，并且该方法 的速度和效率非常高，而成本较低。但是，该方法仍然要求种子的萌发W从胚根或根收集根 边缘细胞，该需要种植空间。
[0014] 可选地，可W从种子提取DNA，然后可W分析W确定该种子如果播种了将会长成 的植物的基因型。提取DNA的最常用的操作涉及W某种其它方式破碎（crushing)、研 磨（grinding)或破坏所述种子，从而不可能仍然利用本可从该特定种子长成的特定植 物个体。另一种方法涉及通过例如切割装置（device)或激光束W该种子仍然保持活力 并且W后可W种植的方式切掉种子的一小部分，包括胚乳（但不包括胚）。该些方法是 例如在W下文献中所述的；欧洲专利申请EP2200419和W02011/082316、W02011/119763、 W02011/163326W及W02011/163362。
[0015] 该些技术要求精密的和复杂的装备（equipment),因为种子需要W精确和高度可 重复性的、一致的方式定位，并精也切割从而不会严重损伤胚，在组织收获过程后应当仍然 可W从其中发育出植物。每一方法均需要大量技术和实验开发、优化和测试时间，直到能够 有可能对任何给定的植物物种获得可靠的和有用的结果。
[0016] 一个具体困难是事实上即便单一物种的种子也并不总是具有完全相同的性状、 大小和重量，例如由于遗传和/或环境变量所致，并且该使得该些自动化高通量种子碎裂 (chipping)方法的实际应用进一步复杂化，即使是针对单一物种的种子。尤其是对于圆种 子的物种，该样的自动化方法非常难W标准化和优化，因为具有该样形状的种子内的胚的 确切位置是无法预测的。切掉该样的种子的随机部分很容易会造成胚的损伤和取样的种子 中的高死亡率，而该正是人们希望非破坏性的方法去避免的，所述方法用于选择带有期望 的基因型变体的种子W随后将它们长成植物。
[0017] 在本发明中，从植物种子的种皮表面获得母体DNA。大部分植物的种子，包括单子 叶植物（如谷物）W及双子叶植物（豆类和许多蔬菜属于双子叶植物），由H个不同的层或 成分组成。该些部分中的每一个都有自己特定的倍性和发育起源。
[0018]胚，其将最终发育成为新的植物，是二倍体（2n)，具有一套母体和一套父体的染色 体。母体染色体组是由单倍体卵细胞提供的，而父体组由单倍体精细胞提供，当卵细胞通过 花粉管受精时其被运送至胚囊。
[0019]胚乳，通常形成发育胚的营养来源，大多数情况下是H倍体（3n)，具有两套母体和 一套父体染色体。它起源于当二倍体中央细胞与第二个单倍体精细胞融合时，当卵细胞通 过花粉管受精时其被运送至胚囊。
[0020] 种子的外层是种皮或外种皮（testa)。它由退化的母体胚珠珠被发育并因此与母 本的母体化基因组相同，而没有来自父本的花粉的任何贡献。
[0021] 由于在倍性和起源中的该些区别，取决于所检查的组织层的类型，种子组织的分 析可W产生不同的结果并可用于各种目的。完整种子或其包含胚乳和/或胚的部分的检查 获得有关其可W产生的植物的基因型的信息。该基因型包含母体W及父体的遗传信息。种 皮的研究具体地获得关于种子所起源的母体亲本的基因组的数据。但是，现有技术教导了 从种皮获得DNA在技术上是非常困难的。种皮的物理去除是非常乏味W及精确的活动，并 且其仅产生非常少量的组织。随后，DNA需要从该组织提取，之后可W对其进行测定。通常， 种皮组织的去除会严重损伤种子，它们通常会无法再用了，肯定不会用于商业目的。
[0022] 本发明提供了一种从种皮表面获得DNA的有效的和非破坏性的方法。该DNA与种 子的母体亲本的DNA相同。该样获得的DNA可用于收集有关种子的母体亲本的基因组的信 息。母体亲本的基因组包括母体亲本植物的核基因组和细胞质（细胞器）基因组。
[002引植物或植物组织的倍性是由核染色体数目确定的。但是，一些基因存在于核外DNA上，其可W在特定的胞质细胞器（如叶绿体和线粒体）中找到。胞质细胞器存在于细胞的 细胞质中，其围绕细胞的细胞核。在许多细胞中，细胞器大量存在，由于在该样的细胞中细 胞器DNA的高拷贝数使得很容易检测细胞器DNA。带有细胞器的细胞质例如存在于卵细胞 中，其是由母本产生的配子。
[0024] 当卵细胞由通过花粉管递送到胚囊的来自父本植物的两个精细胞（另称为"生殖 细胞（generativecell)")之一受精时，通常没有花粉粒的细胞质（包含父本植物的细胞 器）与精子细胞核一起转移。几乎在所有情况下，在两个生殖细胞中完全不存在细胞器，其 原因是因为在花粉发育过程中发生的第一次花粉有丝分裂期间细胞器的不对称分布。该种 不对称的第一次花粉有丝分裂导致形成一个大的营养核和一个小的生殖核。由此，营养细 胞通常会保留所有小抱子的细胞器及其几乎所有细胞质，而生殖细胞通常只接收非常少量 的细胞质，并且不接受细胞器。
[0025] 后来在花粉发育中，生殖细胞一其存在于营养细胞的细胞质内一再次分裂 (第二次花粉有丝分裂），产生两个生殖细胞。因此，当卵细胞由来自父本植物的两个生殖 细胞之一受精时，该导致带有唯一母体起源的细胞质细胞器的合子，W及由来自亲本双方 基本上平等贡献组成的核基因组。因此，父本仅贡献核DNA给受精卵，但没有细胞器DNA。 因而，核外DNA只通过母体亲本继承。该个过程被称为细胞质遗传。
[0026] 可W在细胞质中发现几个重要的植物育种基因，包括在几个植物物种中的雄性不 育基因。如实施例2所述，细胞质雄性不育（CM巧基因可W例如仅通过母本被继承。
[0027] 有许多有趣的特征可W从分析种子的母体DNA确定。有关种子的母体亲本的信 息（即有关母体贡献给种子基因组的信息）可W产生关于种子起源的数据。此类信息 对系统发生分析和其它进化研究或对散布的种子进行追踪W评估种子移动是非常有用 的。例如，在某些研究领域中，通过比较种皮DNA而追踪由鸟类散布的种子。通过鉴定哪 些种子起源于同一母体，可W跟踪种子离开该母体植物（例如个体树）的移动，并且可W 建立不同种子池内和之间的遗传变异（例如地理上的不同HGrivetetal. (2005),Mol. Ecol. 14:3585-3595)。然而，从种皮收集DNA是非常麻烦的，因为现有技术中的方法均涉及 从种子物理去除种皮。
[0028] 如果父本的身份（identity)未知，则杂交基因组的母体成分的信息（除了该杂交 基因组本身的遗传组成信息之外的）也可用于推导有关种子的父本的遗传身份和基因组 性质的信息。
[0029] 商业种子公司有其它原因而对获得有关种子的母体亲本信息的可能性有兴趣。一 项重要的商业应用是本发明在种子的质量控制中的用途。
[0030] 当商业植物品种的种子大规模生产时，许多不同品种通常同时并同地产生。显然 在该过程中可能发生错误，并存在一定的污染的风险。有可能错误的亲本被用于某种生产， 或所使用的亲本仍然包含不期望的遗传变异。另外，在种子的收获和进一步加工过程中可 能发生混合。因为对种植者来说种子对于某种作物是必不可少的原料，最重要的是种植者 确实得到他在种子公司订购并预期收到的东西。因此，质量控制是种子公司的一个重要职 责，W确保其客户收到尽可能高质量和一致性的种子。
[0031] 此外，取决于所用方法，质量控制活动需要大量的时间、空间和/或金钱，它们可 W显著推迟大量的商业种子进入市场。因此，非常重要的是，在该过程中尽可能早和尽可 能快地获得关于可能的杂质的信息。种子批次中的杂质可能来自不同原因。母体核酸 的分析可用于确定特定的种子是否来自正确的母体植物，并从而确定种子批次是否是均 一的。可W通过分析种子的母本基因型鉴定的可能的问题是错误的种子身份、在种子生 产过程中的各个阶段可能已经发生的种子批次的混合（例如亲本系的种植、授粉/施服 (fertilisation)、收获W及种子的装袋）W及母体亲本的非均一性或非纯合性。
[0032] 对大量商业种子进行质量控制W检查种子的生产批次的身份、纯度和均一性。可 WW各种方式实现质量控制，例如通过分子方法或通过种子的代表性样品的表型的体内观 察。任意一种方法会导致一定量的宝贵种子的损失，因此该操作是破坏性的并且进行过操 作的种子不能再进行销售。本发明允许来自种子的母体DNA的非破坏性取样，而不削弱种 子的活力或萌发能力。因此，在已经发生取样后种子仍然可W储存、萌发并在市场上销售。 该个特征使得本发明特别适合于质量控制目的。该应用如实施例4所示。
[0033] 种子母体DNA的特定分析的另一个重要应用在于在大型植物群体中鉴定遗传变 异。一个例子是诱变的植物群体，如通常在例如T比LING方法中获得的。个体或成批种子的 母体基因组的分析可W大大减少鉴定携带期望的遗传变异的植物个体所需的时间、成本、 劳动力和种植空间。该如实施例5所示。
[0034] 本发明提供了一种用于分析种子的母体DNA的非破坏性方法，包括W下步骤：将 种子与流体接触W从种皮表面脱落DM，并分析从所述种皮表面脱落的DNA。所述种子与所 述流体的接触优选在容器中实现，其允许从所述流体轻松取样W及取样过程的自动化。
[0035] 根据本发明，来自种皮表面的DNA是W非破坏性的方式获得的，包括将该种子与 流体接触。非破坏性意味着该种子没有W任何方式被破碎或被损伤，从而它保持其萌发和 生成植物的能力。
[0036] 本发明的"种子的母体DNA"包括产生该种子的母体植物的基因组DNA。该DNA可 W是核和/或细胞质来源的，并且它允许例如鉴定产生所述种子的母体植物，W及鉴定对 种子基因组的母体贡献。可通过不同核酸分析技术检查该母体DNA，优选采用高度灵敏的检 测方法。该些分析技术是本领域技术人员公知的。
[0037] 种子和流体之间的接触是通过将所述种子浸在所述流体中或通过将所述种子漂 浮在所述流体上实现的。任选地，可W轻轻揽拌在所述流体内的种子W促进DNA脱落进所 述流体。但是，该对于获得种皮DNA并不总是必需的。还可W用流体漂洗所述种子。与种 子接触或用来漂洗的流体是水溶液，如水或缓冲液。
[0038] 在流体中或流体上一段短时间之后，种子可W或者从流体中取出，或者留在流体 内。优选立即分析现在含有种皮DNA的流体。本发明中"一段短时间"是指比吸涨（imbibe) 种子并不可逆地触发萌发所需的时间显著更短的一段时间。合适的时间是在30砂至30分 钟之间，优选在1至15分钟之间，更有选在2至5分钟之间。
[0039] 如果种子从流体中取出，该种子可W干燥并储存。如果在种皮DNA已经收集之后 立即取出并干燥回来，则本方法并不影响该种子的萌发能力。因此，通过采用本发明的方 法，所分析的种子没有被损伤，并且，如果需要的话，之后它仍然可W储存、萌发并市售和使 用。
[0040] 已经与种子接触的流体含有来自种皮表面的DNA。该DNA起源于种子的母体亲本。 该母体DNA可用于分析所期望的任何遗传信息。因此，种子的母体亲本的基因组（核和细 胞器二者的）可W通过分析由所述母体亲本植物产生的种子的种皮表面所获得的母体DNA 来进行检查。该可W用于例如确认属于一批种子的个体种子是由遗传上的同一母体植物产 生的，或检测属于一批种子的个体种子的不同母体来源。该些应用在例如商业种子生产的 过程中或之后的质量控制的情况下是有用的。
[0041] 因此，本发明提供了一种用于通过分析母体DNA检查种子的母体基因组的方法， 所述母体DNA对应于产生该种子的母体植物的DNA。因此，对种子基因组的母体贡献可从 所获得的关于母体植物的基因组组成的信息推导出来，并且可W鉴定产生该种子的母体植 物。在本发明的方法中，种子的母体DNA通过将种子与流体接触W从种皮表面脱落DNA而 获得，并且随后可将从种皮表面脱落的DNA用于分析。
[0042] 本发明的方法不需要任何组织取样或DNA提取方法，除了与流体接触。此外，也不 需要特殊的装备，除了DNA分析装备。因此，所提出的方法是高效并且具有成本效益的。
[0043] 取决于所使用的DNA分析方法，从干燥的种子开始，可W在20分钟之内获得结果， 该使得获得种子的遗传信息及其母体起源是一个极其快速的操作。重要的是，实施本发明 无需种子的萌发，并且该方法可W应用于具有种皮的所有植物物种，而无需对操作步骤进 行重大修改。针对不同植物物种对本方法优化仅仅涉及将种皮DNA脱落至周围液体介质可 能需要的揽拌频率和/或持续时间的微小变化。因此，该方法能够非常快速地对来自种子 的母体亲本的DNA或种子群体的母体亲本的DNA取样，所述DNA随后可采用标准DNA分析 方法进行分析。
[0044] 本发明的方法可W按比例放大至高通量设置，该样能够从大量平行个体种子的或 从大量个体种子批次同时分离母体DNA。在此情况下，所述方法可W是自动化的或机器人化 的，导致在从植物群体进行DNA分离操作的所有步骤中非常显著地降低了成本和劳动力。 含有流体（种皮的DNA脱落在其中）的容器可W是多管形式或微板或大板形式的一部分， 其与用于高通量分析大型植物群体中的母体DNA的自动化系统兼容。在该样的自动化设置 中，可W平行分析许多种子。因此，该方法特别适用于筛选大型群体的种子，并且它可W很 容易地应用于例如质量控制和植物育种。
[0045] 因此，根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种用于大型植物群体的高通量DNA 分析系统，包括布置成用于将一个或多个种子与流体接触W从种皮表面脱落DNA的容器阵 列，W及用于分析从所述种皮表面脱落的DNA的装置。该系统尤其适用于分析母体DNA。
[0046] 在高通量设置中，多个容器可W排列成一排，或W多孔板形式布置，并且在该些容 器的每一个中，种子可W与流体接触。
[0047] 本发明的方法的自动化包括W下自动化步骤：将个体种子与流体（其位于容器 中）接触，任选地，揽拌流体W促进种皮DNA的脱落，从流体取出种子，W及任选地干燥种 子。任选地，同样的自动化设置还可W进行收集含有种皮DNA的流体用于进一步分析的步 骤，W及任选地还可W进行所述DNA的实际的分子分析。种子还可W被自动化地加入到容 器内的流体中。
[0048] 可W设想所要求保护的方法的另一个高通量应用，包括多于一个种子与单个容器 中的流体接触，并且随后进行所述方法的步骤。该应用能够同时分析多个种子的母体DNA， 例如商业种子批次的代表性样品，或从一个母本植物或一组母本植物收获的种子的代表性 样品。它允许在该样的种子批次中筛选遗传变异，目的是例如验证该种子批次中所包括的 种子的母本植物或那些母本植物的均一性和身份，或鉴定含有有趣的遗传变异的种子批次 (例如在TILLING群体中，其中来自一个突变植物或一些突变植物的种子可W在一批中一 起分析，并筛选母体植物中感兴趣的基因组区域内特定遗传变异的存在。该允许有效鉴定 突变植物中的突变，所述突变能够传递给下一代一即所分析的种子批次的种子一即便 该些突变W低频率发生，并且无需破坏性组织取样，如实施例5中所解释的）。
[0049] 本发明将在下面的实施例进一步说明。在实施例中参考了下列附图：
[0050] 图1显示通过种皮DNA中所检测到的CMS标记的方式，检测在一批雄性不育甘蓝 种子中污染的可育甘蓝子代（progeny)。
[0051] 图2在上图中显示了当对本发明的所述方法所获得的DNA进行测试时，对核标记 所获得的标记分数（英光点）。除了纯合的AA(绿色?，父体等位基因）和杂合的AB(蓝色 O)对照样品分数之外，所有样品得分为纯合的BB(红色□，母体等位基因），该证实了利 用本发明的所述方法所获得的DNA样品中只有该核标记的母体等位基因可被检测到。相比 较而言，图2的下图显示了当对从相同种子采用标准的、破坏性DNA分离方法提取的基因组 DNA进行测试时，对相同核标记所获得的结果。该分离清楚地导致了杂合DNA的分离，因为 在该测试中所有实验样品对该核标记得分为杂合（蓝O)。 实施例
[0052] 实施例1
[0053] 从甘蓝炬rassicaoleracea)种子的种皮获得DNA
[0054] 92个甘蓝种子置于96孔板中，然后加入50U1无菌MiIliQ水。将板密封，并在涂 料揽拌器（paintmixer)中揽拌2分钟。随后，采用96孔PCR板中的高灵敏度DNA检测分 析（ABgene),立即将5y1的水用于DNA分析。采用该方法获得的种皮DNA可W用于遗传分 析，该将在下面通过其它实施例进行说明。同样的程序也可W用于来自其它植物物种的种 子，并且采用其它DNA分析技术和设置，该将在下面通过其它实施例进行说明。涂料揽拌器 中的揽拌并没有影响到种子的萌发能力。
[00巧]实施例2
[005引细胞质DNA的分析
[0057] 该实施例说明，本发明可用于区分雄性不育（CM巧和完全可育的植物，而无需 先萌发种子并种植植物。该在例如发生杂交种子批次或亲本系的污染，W及可育种子 错误地与雄性不育种子一起收获时是需要的。如果有遗传标记可用于区分雄性不育 (male-sterility)和雄性可育能力（male-fedility)并且如果采用本发明的所述方法， 那么在种子阶段就有可能进行该检测。因而该种方法极大地节约了植物的种植空间。如果 没有该样的测试，所有的植物都需要生长成熟，并在它们开始开花后检查雄性可育能力。所 有可育植物都需要在种子生成前被鉴定出来并从群体中去除，该要求劳动力的投入和宝贵 种植空间的浪费。
[0058] 本发明允许从种子批次中特异性选择出雄性不育种子（即将会长成雄性不育植 株的种子），然后，育种者可W放也地在他的所有可用种植空间内种满已经确认为雄性不育 的个体。通常线粒体一其携带它们细胞器基因组中的CMS标记一在每个细胞中W多拷 贝的形式存在，该一事实极大地提高了该方法的灵敏度。因此，种皮DNA样品中CMS标记的 高拷贝数使得该标记易于检测。
[0059] 本实验中采用了一批西兰花化roccoli)种子（其由83个种子组成，所述种子携 带细胞质雄性不育（CM巧性状）W及5个花菜（cauliflower)种子（其缺乏该性状，并且因 此可W生长成为完全可育植株）。将该批种子分别置于"筛选同伴管（screenmatetube)" 板的孔中，每孔加入50y1无菌MilliQ水，并且进行如实施例1中所述的操作。将种子赔 育3分钟，并随后在涂料揽拌器中60化pm揽拌20砂。随后通过PCR的DNA分析正确地在 该88个种子的种子批次中鉴定到该五个可育种子。
[0060] 图1显示了该实验的结果：与缺失该CMS标记的两个对照样品一起，缺失CMS标记 的该五个花菜种子样品可W清楚地与该批次的其它种子区分开。该方法允许在一批"雄性 不育"种子中检测出"污染的"可育后代。
[00川 实施例3
[0062]获得关于种子的母本植株的遗传信息
[0063] 该实施例证实用所要求保护的方法获得的DNA纯粹起源于母体。首先将甘蓝种子 经受如本发明实施例1所述的非破坏性的DNA分离步骤，并随后经受常规的、破坏性的DNA 提取方法，其中对于后一目的，所述种子被均质化。对由该两种不同方法从相同种子已经获 得的DNA测试核DNA标记。对于该特定标记，已知杂交种子的父本植株对A等位基因是纯 合的，而杂交种子的母本植株对B等位基因是纯合的。因此，在该测定中所分析的种子的核 基因组在所有情况下对于该特定标记均是杂合的（AB)。
[0064] 图2在上图中显示了当对用本发明的所述方法所获得的DNA进行测试时，针对该 测试的核标记所获得的标记分数（英光点）。除了纯合的AA(绿色?)和杂合的AB(蓝色 O)对照样品分数之外，所有样品得分为纯合的BB(红色□)，该证实了在用本发明的所述 方法所获得的DNA样品中只有该核标记的母体等位基因可被检测到。
[006引相比较而言，图2的下图显示了当对从相同种子采用标准的、破坏性DNA分离方法 提取的基因组DNA进行测试时，对相同核标记所获得的结果。该分离显然导致杂交DNA的 分离，因为在该测试中所有实验样品对该核标记得分均为杂合（蓝O)。
[006引 实施例4
[0067] 种子批次中遗传污染的检测
[0068] 向一批89个杂交甜椒种子（甜椒Capsicumannuum)(由从特定父本系获得的花 粉对雄性不育母本系（携带GMS性状）产生的）混入由遗传上不同的母本系产生的四个种 子（W模拟杂交种子批次意外污染了来自不同品种（variety)或母本系的种子背景程度）。 将所述种子分别置于96孔板的孔中，并应用实施例1的操作。
[0069] 随后，对等份液体立即通过PCR进行分析，W检测各种遗传标记的存在与否，该些 遗传标记能够区分在相同的种植设备（facility)中经常同时采用的不同甜椒母本系。由 正确的母本系产生的所有89个杂交种子对于其相应的标记得分为正，该四个"污染的"种 子对于该标记得分为负。然而，该四个种子对于另一标记得分为正，而其它89个种子对于 该标记的得分为负。因此，该分析明确检测出不对应于所期望杂交基因型的另一个母本系 的四个"污染的"种子。
[0070] 为了进一步加速对生产设备中"污染的"母本系的检测，还可W将来自所有93个 种子的液体混合（或可W整体提取来自该种子批次的种皮DNA)，并可W对所混合的液体测 试特异性针对生产设备中所采用的每个母本系的遗传标记。在当前实施例中，该方法能够 在该种子批次中实现两个不同母体来源的阳性检测，指示存在某种污染水平，该样两个不 同母体来源的阳性检测是由于存在来自除了旨在用于产生该特定杂交品种的母本系之外 的另一母本系的种子所导致的。因此，该种简单的测试能够快速警告；从中取得该样品的整 个种子批次应当进行更加仔细地分析。
[00川实施例5
[0072] 大型诱变群体的遗传分析
[0073] 在植物育种领域中，反向遗传学的应用日益普遍。反向遗传学涉及到该样的方法， 其中分离基因，和通过修饰它们的一级结构和/或表达来确定基因的功能。随着目前在基 因功能方面认识的增加（尤其是在模式系统如拟南芥（Ar油idopsistholiana)、水稻和玉 米中），反向遗传学方法现在在作物系统中获得了功效。
[0074] 为了确定特定基因或等位基因的存在，大量诊断性DNA工具对本领域技术人员来 说是可用并且已知的。筛选植物群体的成本在很大程度上由对所研究的群体的个体植株 的种植和取样W及从该些样品分离DNA所需的劳动力和空间决定。在研究过程中，如果一 个群体作为代表存在于该群体的个体植物中的遗传变异的种子样本是可获得的，大量的劳 力已经花费在了逐株收获作为家系中的相关个体的种子。一旦对植物的组织已经取样，在 萌发或种植植物之后，优选的植物不得不立即使用或种植至成熟W确定其遗传价值和身份 (identity)。该过程一旦启动，就不能被终止或逆转。未能及时研究群体中的可用表型和 基因型信息可能导致有趣的遗传组合或有趣的等位基因的不可逆损失。
[00巧]例如，当一群植物或种子已经经受了诱变（采用本领域技术人员已知的诱导突变 的操作步骤），首先获得MO群体。根据由最常用于诱变的随机方法（如甲賴酸己醋）所诱 变的特定细胞，MO植物通常是嵌合的。该意味着MO植物的不同部分的遗传组成是不同的， 并且在该植物的一些区域（sector)中细胞可能携带感兴趣的突变，而在相同植物的其它 区域中细胞携带该基因的野生型等位基因。所述区域的大小取决于最初诱变的细胞的发育 命运，例如在经受诱变剂的种子中，并取决于在整个植物发育中从所述诱变细胞（或细胞 的区域）所产生的细胞谱系的功能。
[0076] 通常只有存在于植物的生殖系（即最终引起花粉颗粒和/或卵细胞形成的细胞谱 系）中的突变可W被传递给下一代。随机诱变方法通常导致该样的MO植物，其中一些花产 生携带期望的突变的种子，而同一植物的其它花产生不携带所述突变的种子。理论上有可 能详细检查该种变异并区分该两种类型的花，但考虑到突变群体的大小通常非常巨大并且 投入到该样的工作所需的时间和劳动力，该不是一个研究者会去思考的事情。
[0077] 通常情况下，从每个个体植物收获来自MO植物的种子，而并不因此在该植物的个 体果实之间进行区分。因此，在许多情况下，那些种子一称为Ml种子一对于所期望的突 变不是均一的（其中MO植物的生殖系是嵌合的）。因此，在其中所诱变的区域仅局限于一 朵或几朵花的生殖系的情况下，人们会很容易地忽略该突变的存在，因为携带该突变的Ml 种子在从相同MO植物所收获的整个Ml种子批次中相对比较少见。研究者通常没有足够的 种植空间来处置萌发、种植和分析来自他的整个诱变群体的每个单独MO植物的所有Ml种 子，并且当分析每个MO植物的后代的随机的小种子样品时，可能不会观察到仅W相对小的 百分比存在于Ml种子中的突变。
[0078] 采用本发明的方法，快速分析种子批次中产生所述种子批次的母本植物中期望突 变的存在是可行的。本发明的方法既可用于Ml种子，也可用于M2种子，或来自后代的种子。 一旦已经检测到给定种子批次中期望突变的存在，由该母本植物（或那些母本植物）所产 生的所有种子可W在个体基础上采用本发明的非破坏性方法进行分析，并且随后该些种子 仍然可W播种并萌发。
[0079] 该方法可W允许鉴定其母本携带所述突变的个体种子，即便它们在由所述植物或 该些植物产生的一批种子中是少见的。该策略极大地优化了例如TILLING方法的效率，其 中研究者着眼于在基因组的预定区域中的突变。具有很高几率携带所期望的突变的个体、 非萌发种子的快速鉴定，使得没有必要种植所有Ml种子、或所有M2种子、或来自任何后代 的所有种子，因为它允许选择性种植那些母本植物携带感兴趣突变的群体的个体。该节约 了种植空间、劳动力和时间。
[0080] 可选地，如果诱变植物群体的M2代是可用的，本发明的方法的应用允许一个非常 类似的方法。M2群体具有不再存在嵌合现象，突变可能W纯合状态存在的优势，该有利于所 述突变的表型效应的分析，即便它们本质上是隐性的。
[0081] 然后，有可能例如在每个个体M2种子池或种子批次（其中每个种子池是从或者单 个Ml植物或者一组个体Ml植物收获的）中筛选期望突变的存在，并因而鉴定特别感兴趣 的M2种子批次（即由在感兴趣的基因组区域携带突变和/特定的期望突变的母本植物所 产生的）。然后可W选择仅萌发预先选定的批次的种子（其中在母体基因组中已经检测到 感兴趣的突变），而不是萌发来自每个M2种子批次的种子并随后用现有的破坏性DNA分离 操作步骤从苗或成熟植物的部分（如叶盘）分离DNA。
[0082] W该种方式，再也不需要种植成千上万缺乏所期望的遗传变异的植物，并且研究 者可W选择特异性种植其中他知道检测所期望的突变的机会很显著的植物，因为所述突变 在之前已经被显示存在于所选定的种子批次的母体DNA中了。当将W杂合状态携带所述 突变的Ml植物自交而获得M2种子时，在不存在分离异常的情况下，预计在所述M2种子的 75%的基因组中实际存在该突变。当Ml植物已经自交时，在显性突变的情况下通常可W在 75%的M2植物中观察到其表型表达，在隐性突变的情况下可W在25%的M2植物中观察到 其表型表达。
[0083] 该方法大大降低了对大型种植设备的需求，因为仅来自选定的M2家系的种子需 要播种、萌发并种植至成熟，而不是所有的M2家系（其可W很容易地将所需要的实验空间 在规模上缩小至100分之一或更小）。
[0084] 此外，采用本发明的方法，研究者甚至可W进一步按比例缩小他的诱变项目 (project)。如果M2种子群体由多个M2种子批次组成，其中每个批次由多个Ml植物（形 成Ml家系）的合并的种子组成，期望的突变的阳性鉴定结果将表明产生所述M2种子批次 的Ml植物中至少之一携带所期望的突变。
[0085] 但是，因为在阳性得分的M2种子批次中包含的种子的混合来源，将不清楚在该种 子中所包含的个体种子的多大百分比实际上携带所述突变。如果例如十株Ml植物的种子 已经被汇集形成M2种子批次，并且该十株植物中仅有一株携带所期望的突变，那么在M2种 子批次的种子中携带所期望的突变的种子会相对比较少见（例如，预计通常大约该些植物 的10%的75%携带该突变，其为大约7. 5%，或40株植物中有3株，而且，在隐性突变的情 况下，该3株植物中仅1株将有可能表现出突变表型，即40株植物中有1株）。因此，在已 经在M2种子批次的代表性样品的母体DNA中检测到期望的突变后，所述种子批次内所包含 的所有个体种子可W随后通过本发明的非破坏性方法进行单独分析，W精确鉴定由Ml家 系中携带所述突变的Ml植株（或那些植株）所产生的那些个体种子。
[0086] 该高通量方法允许从M2种子的亚群的混合M2种子池中选择携带所述突变的Ml 植株（或那些植株）所产生的种子。该种预选极大地丰富了存在所期望突变的种子的群体 (其最终播种、萌发并种植用于分析）。当Ml植物（其对突变来说是杂合的）已经自交时， 在显性突变的情况下通常可W在75%的该些预选的M2植物中观察到其表型表达，在隐性 突变的情况下可W在25%的所述预选M2植物中观察到其表型表达。
[0087]尤其是对于具有大尺寸的植物物种，其通常要求每个个体植物有大的种植空间， 通过采用本发明方法而按比例缩小的策略是非常有吸引力的。它可W大大降低成本和占用 空间，并且可用的空间和人力可W方便地用于其它项目和活动。
[008引 实施例6
[0089] 反向子代作图（!ReverseProgenyMapping)效率的提高
[0090]当将其结合本发明的方法，可W进一步改善如欧洲专利申请EP2366792所述的反 向子代作图方法并使之更加高效。反向子代作图是一项利用了W下事实的发明：通过第二 次分裂重建（SDR，第二次减数分裂的简称）所产生的SDR-O植物在它们的基因组中具有残 余杂合性，与双倍体值H)植物相反，后者是完全纯合的。该残余杂合性是由于W下事实：重 组（染色体交换）在第一次减数分裂过程中已经发生了。SDR-O植物产生SDR-I种子，可 W在该SDR- 1代中观察到在SDR-O母本植物属杂合的染色体区域中存在的任何性状的分 离。当观察到感兴趣的表型在由特定的SDR-O植物获得的SDR-I植物中分离时，可W对该 SDR-O植物的基因组进行基因分型，W鉴定哪些精确的染色体区域是杂合的。该些杂合区域 是感兴趣性状的基因组定位的候选区域，W该种方式该性状可W在基因组中作图，并且可 W鉴定其潜在的基因组序列。但是，该方法的要求是收集并存储所有SDR-O植物的基因组 DM,可W从所述植物中收获SDR-I种子W用于随后的SDR-I植物的分析。该种采用常规方 法的DNA分离不仅需要劳动力和时间，而且增加了实验成本。
[00川当将本发明的方法应用于反向子代作图时，不再需要从SDR-O植物收集DNA。在播 种前，可W对SDR-I种子进行如实施例1所述的本发明的非破坏性方法，W从它们的种皮收 集母体DNA。对于每个个体SDR-I种子，该DNA对应于产生该种子的SDR-O植物的基因组 DNA。然后，可W在SDR-O基因组（其已从SDR-I种子的种皮分离到）中查找在SDR-I群体 中发生表型分离的任何性状的基因组基础。可选地，可W收集从同一SDR-O植物收获的仅 一个或少量SDR-I种子的种皮DNA，因为对于由同一母本SDR-O植物产生的所有SDR-I种 子而言预计该是相同的。任何SDR-I种子的种皮DNA代表产生该种子的SDR-O植物的母体 DNA，因而还代表由同一SDR-O植物收获的所有SDR-I种子的种皮DNA。
[0092] 类似地，本发明的方法可用于进一步改善其它方法，例如近反向育种 (Near-ReverseBreeding)(WO2006/094773)。
【权利要求】
1. 一种用于分析种子的母体DNA的非破坏性方法，包括以下步骤：将种子与流体接触 以从种皮表面脱落DNA，并分析从所述种皮表面脱落的DNA。
2. 权利要求1所述的方法，其中所述流体包含于容器中。
3. 权利要求1或2所述的方法，其中所述种子被浸在所述流体中。
4. 权利要求1或2所述的方法，其中所述种子漂浮在所述流体上。
5. 权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述种子在所述流体内被搅拌。
6. 权利要求1或2所述的方法，其中所述种子用所述流体漂洗。
7. 权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述流体是水溶液。
8. 权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述流体是水。
9. 权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述种子从所述流体中取出，并且所述流 体用于母体DNA的分析。
10. 权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述种子随后被干燥用于贮存。
11. 通过分析母体DNA而检查种子的母体基因组的方法，其中所述DNA是由权利要求 1-10中任一项所述的方法获得或产生的DNA。
12. 权利要求11所述的方法，其中所述DNA是如下获得或产生的DNA:将种子与流体接 触以从种皮表面脱落DNA，并分析从所述种皮表面脱落的DNA。
13. 权利要求2-10中任一项所述的方法，其中所述容器是用于高通量分析大型植物群 体中的母体DNA的自动化系统的一部分。
14. 权利要求1-13中任一项所述的方法，其中将一个以上的种子与容器中的流体接 触。
15. -种用于大型植物群体的高通量DNA分析系统，包括布置成用于将一个或多个种 子与流体接触以从种皮表面脱落DNA的容器阵列，以及用于分析从所述种皮表面脱落的 DNA的装置。
【文档编号】A01H1/04GK104379743SQ201380029715
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年6月6日 优先权日:2012年6月7日
【发明者】C·M·P·梵顿 申请人:瑞克斯旺种苗集团公司