利用电击仪转化大豆胚尖生长点的方法
【专利摘要】本发明涉及一种大豆胚尖生长点转化方法。利用萌发2~3天的大豆种子，去掉种皮、一片子叶及真叶，暴露生长点后，将大豆胚尖进行酶解得到大豆胚尖原生质体，放入电击杯中进行电击，然后通过农杆菌侵染大豆胚尖原生质体，吸去表面菌液后放入暗处，共培养后接转到营养土中培养，再生率为89%，F1代检测转化率为5%。本发明未经组织培养阶段，也不需要严格无菌环境，操作简便，转化周期短，用于大豆基因工程的基本操作系统，对于大豆品质改良具有重要的理论和实践意义。
【专利说明】利用电击仪转化大豆胚尖生长点的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用电击仪转化大豆胚尖生长点的方法。利用电击仪直接电击大 豆胚尖顶端原生质体形成生长点细胞的电穿孔，然后借助农杆菌介导来实现转化大豆的遗 传转化方法，属于大豆转基因研究领域。
【背景技术】
[0002] 大豆(L. )Merr.」原产我国，属于豆科、蝶形花亚科、大豆属的二倍 体（2n=40)植物，大豆不仅是世界最大的油料作物，还是食品、饲料等多种加工工业的优质 原料，是一种重要的经济作物。近年来，我国大豆面临着国际市场廉价大豆产品（特别是转 基因大豆产品）大量进口的压力与挑战，直接导致国内大豆价格不断下降，种植效益明显 下滑，使我国失去了发展大豆产业的掌控权，并对数千万大豆产区从业人口的生计造成威 胁。因此大力发展我国具有自主知识产权的转基因大豆十分必要。
[0003] 然而，大豆的遗传转化受到许多因素的限制。1984年，大豆的遗传转化研究首次被 报道，从第一棵转基因大豆的诞生到现在，整整30年已经过去，大豆的遗传转化效率仍未 得到提高。主要是由于大豆离体组织培养再生难，再生体系尚不完善，致使大豆遗传转化效 率普遍偏低。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种大豆胚尖生长点转化方法，即利用电击仪直接电击大豆 胚尖生长点形成胚尖细胞的电穿孔，然后通过农杆菌介导将外源基因插入到大豆基因组 中。其特征是利用萌发2~3天的大豆种子，去掉种皮、一片子叶及真叶，暴露生长点后，将大 豆胚尖进行酶解得到大豆胚尖原生质体，放入电击杯中进行电击，然后通过农杆菌侵染大 豆胚尖原生质体，吸去表面菌液后放入暗处，共培养后接转到营养土中培养，再生率为89%， F1代检测转化率为5%。目前大豆遗传转化最常用方法是基因枪轰击未成熟子叶法和农杆 菌介导子叶节法，但是这两种方法均涉及组织培养阶段，存在转化周期长、转化率低、对基 因型依赖性强等缺点，本发明打破了传统组织培养转化方法的局限，具有操作简便、周期 短、移栽成活率高等特点，是一种简易、高效的大豆遗传转化技术体系。
[0005] 本发明提供的一种大豆胚尖生长点转化方法包括的步骤如下： 1、大豆胚尖原生质体的获得 挑取种皮完整、无病斑且饱满的成熟大豆种子，准备500 mL 口杯，将挑选好的大豆种子 放入口杯附带的网兜中，于通风橱中在口杯底层倒入次氯酸钠溶液15 mL，然后加入浓盐酸 5 mL，二者发生反应产生氯气，迅速将装有大豆的网兜放入口杯中，盖好盖子于通风橱中放 置5小时。
[0006] 于超净工作台中，在9cm玻璃平皿中放入2张无菌滤纸，并加入8mL无菌水。每一 平皿放入15粒消毒后的大豆种子。25-28°C黑暗环境中萌发2~3d。取胚根萌发至0.5~2cm 的大豆种子，利用镊子与解剖刀剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，小心去掉一片子叶 和所有原叶，暴露胚尖顶端，自然条件下稍微晾干。将胚尖浸入1%纤维素酶+1%半纤维素 酶+0. 25%果胶酶混合酶解液解液中处理，得到大豆胚尖原生质体。
[0007] 2、农杆菌工程菌液的制备 挑取含有质粒PS0Y12的农杆菌单菌落接种到10ml含相应抗生素（50mg/L卡那霉素 +50mg/L氯霉素+50mg/L壮观霉素）的LB液体培养基，28°C，200 r/min振荡培养至对数生 长期。取lml菌液放入50ml含相同抗生素的LB培养基中，28°C，200rpm振荡14-16小时， 然后以1 :50进行2次活化，培养至0D600 =0. 5~0. 7。将菌液转移到离心管中，4°C，5000rpm 离心5-8min，收集菌体。重悬液重悬菌体，按1: l(Tl: 20的比例浓缩菌体，制备好的工程菌 液备用。
[0008] 重悬液：1/2 MS+60 g/L 鹿糖+100 μ mol/L AS (乙酰丁香酮)，ρΗ5· 5。
[0009] 3、电击仪电击大豆胚尖原生质体 将大豆胚尖放入电极间隙为4毫米的电击杯中，再将电击缓冲液注入电击杯，使其与 大豆胚尖原生质体充分接触，在2500V电压下电击两次。
[0010] 4、农杆菌侵染及共培养 将经过电击的大豆胚尖原生质体放入预先制备好的农杆菌菌液中进行侵染20分钟， 将侵染后的大豆胚尖原生质体放入灭好菌的带有2层滤纸的玻璃平皿中，每皿放置8粒， 加入2~3mL无菌水，25-28°C黑暗环境中暗培养；3天后，向平皿中加入5~10mL无菌水， 25-28°C光照环境下培养，直至胚尖顶端伸长至0. 5~lcm，此时真叶也开始出现。
[0011] 将泥炭土、珍珠岩、蛭石按4:1:1比例混合，将混合土壤装入直径5cm的黑色塑料 软质小花盆中，充足浇水，将幼苗种入花盆中，光照培养至4-6片叶片长出后，移栽至大田 或大型花盆中，直至开花、接种，收集种子。
[0012] 5、筛选，PCR检测 将T0代种子种入土壤，当小苗长出4-7片新叶时，用筛选剂喷洒植株，筛选出具有抗性 的植株。采用CTAB法提取筛选为阳性的植株的基因组DNA，进行目的基因的PCR检测。
[0013] PCR检测条件：
【权利要求】
1. 一种大豆胚尖生长点转化方法，包括如下的步骤： 1) 大豆胚尖原生质体的获得 挑取种皮完整、无病斑且饱满的成熟大豆种子，准备500 mL 口杯，将挑选好的大豆种子 放入口杯附带的网兜中，于通风橱中在口杯底层倒入次氯酸钠溶液15 mL，然后加入浓盐酸 5 mL，二者发生反应产生氯气，迅速将装有大豆的网兜放入口杯中，盖好盖子于通风橱中放 置5小时； 2) 于超净工作台中，在9cm玻璃平皿中放入2张无菌滤纸，并加入8mL无菌水；每一 平皿放入15粒消毒后的大豆种子；25-28°C黑暗环境中萌发2~3d ;取胚根萌发至0. 5~2cm 的大豆种子，利用镊子与解剖刀剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，小心去掉一片子叶 和所有原叶，暴露胚尖顶端，自然条件下稍微晾干；将胚尖浸入1%纤维素酶+1%半纤维素酶 +0. 25%果胶酶混合酶解液解液中处理，得到大豆胚尖原生质体； 3) 农杆工程菌菌液的制备 挑取含有质粒PSOY12的农杆菌单菌落接种到10ml含抗生素50mg/L卡那霉素+50mg/ L氯霉素+50mg/L壮观霉素的LB液体培养基，28°C，200 r/min振荡培养至对数生长期；取 lml菌液放入50ml含相同抗生素的LB培养基中，28°C，200rpm振荡14-16小时，然后以 1 :50进行2次活化，培养至0D600 =0. 5~0. 7 ;将菌液转移到离心管中，4°C，5000rpm离心 5_8min，收集菌体；重悬液重悬菌体，按l:l(Tl:20的比例浓缩菌体，制备好的工程菌液备 用；其特征在于： 4) 电击仪电击大豆胚尖原生质体 将大豆胚尖放入电极间隙为4毫米的电击杯中，再将电击缓冲液注入电击杯，使其与 大豆胚尖原生质体充分接触，在2500V电压下电击，脉冲作用时间45 μ s，脉冲个数5个， 脉冲间隔〇. 5 s ; 5) 农杆菌侵染及共培养 将经过电击的大豆胚尖原生质体放入预先制备好的农杆菌菌液中进行侵染20分钟， 将侵染后的大豆胚尖原生质体放入灭好菌的带有2层滤纸的玻璃平皿中，每皿放置8粒， 加入2~3mL无菌水，25-28°C黑暗环境中暗培养；3天后，向平皿中加入5~10mL无菌水， 25-28°C光照环境下培养，直至胚尖顶端伸长至0. 5~lcm，此时真叶也开始出现； 将泥炭土、珍珠岩、蛭石按4:1:1比例混合，将混合土壤装入直径5cm的黑色塑料软质 小花盆中，充足浇水，将幼苗种入花盆中，光照培养至4-6片叶片长出后，移栽至大田或大 型花盆中，直至开花、接种，收集种子； 6) 筛选，PCR检测 将T0代种子种入土壤，当小苗长出4-7片新叶时，用筛选剂喷洒植株，筛选出具有抗性 的植株，采用CTAB法提取筛选为阳性的植株的基因组DNA，进行目的基因的PCR检测； PCR检测条件：
PCR 反应程序：94°C:4 min:94°C 30s，56°C 30 s，72°C 45s，30个循环；72 °C10 min。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的重悬液：1/2 MS+60 g/L蔗糖 +100ymol/L AS (乙醜丁香酮），ρΗ5·5。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：培养基配方为：LB培养基：10 g/L胰蛋 白胨+ 5 g/L酵母提取物+ 10g/LNaCl，pH7. 0，固体LB培养基另加15 g/L琼脂。
【文档编号】A01H5/00GK104250654SQ201410099786
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】王罡, 季静, 荣非, 王昱荣, 吴武德 申请人:天津大学