一种通过种间杂交获得高比例雄性泥鳅的方法
【专利摘要】本发明公开了一种通过种间杂交获得高比例雄性泥鳅的方法，它是以雌性大鳞副泥鳅与雄性四倍体泥鳅为亲本进行杂交：对雌性大鳞副泥鳅、雄性四倍体泥鳅腹腔注射催产药物，催产12-16小时后，采集雄性四倍体泥鳅的精巢和雌性大鳞副泥鳅的卵粒，将精巢与保存液研磨混匀后再与卵粒混匀，得受精卵，将受精卵进行孵化，饲养孵化后获得的杂交泥鳅苗，得到高比例的雄性泥鳅。采用本发明获得的三倍体杂交泥鳅群体，其中雄性杂交泥鳅的比例高达87.64-98.53%，雌鱼卵巢发育不良。
【专利说明】一种通过种间杂交获得高比例雄性泥鳅的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及鱼类单性繁育方法，更具体地说，它涉及一种通过种间杂交获得高比例雄性泥鳅的方法。
【背景技术】
[0002]许多的研究表明鱼类单性群体(全雌或全雄群体)在生长速度或维护健康的生态环境方面有着明显的优势。目前国内外生产鱼类单性群体的方法主要有以下几种:性激素直接投喂、三系配套法、雌核发育和种间杂交。性激素直接投喂实现鱼类性别的逆转在以前用的比较多，通过长时间投喂高浓度的雌性或雄性激素往往可以比较顺利地获得全雌或全雄群体。然而通过此方法获得的鱼类单性群体存在很大的食品安全问题，大量的性激素会通过摄食性逆转鱼类流入到人体中，对人类造成巨大的危害。鉴于此，一种新的方法，即三系配套法，得以发明并获得广泛的认可和推广。以性别决定机制为XX-XY型的鱼类为例，如果需要获得全雄群体，首先可通过投喂雌性激素将正常的XY鱼性逆转为生理上的雌鱼，然后再与正常的XY雄鱼进行交配，获得YY超雄鱼，这种超雄鱼需要通过后代测交的方法或利用性别标记进行筛选确定。有研究表明，利用三系配套法可以成功地获得超雄黄颡鱼。另外，有学者还对此方法进行了改进，通过采用激素性逆转结合雌核发育，可大大缩短获得超雄黄颡鱼的时间。雌核发育现今也常被应用到鱼类单性群体的生产中，例如通过雌核发育结合染色体加倍的方法，就可以比较轻易地获得XX-XY型鱼类的全雌群体。相比于性激素直接投喂、三系配套法和雌核发育等方法，通过种间杂交获得鱼类单性群体的方法既不存在食品安全问题，同时还操作简便、效率高。但利用种间杂交获得鱼类单性群体的例子比较少见，最成功的一个案例是利用雌性尼罗罗非鱼(XX)与雄性奥里亚罗非鱼(ZZ)进行杂交获得近乎全雄的罗非鱼群体(奥尼罗非鱼)(雄性比83%-100%)。
[0003]泥鳅和大鳞副泥鳅具有较高的食用和药用价值，是我国最重要的两种经济鳅类。近年来因这两种鳅类的市场价格节节攀升，国内掀起了一场巨大的泥鳅养殖热潮，市场对优良的泥鳅种质资源需求量巨大。自然界中泥鳅的染色体存在着广泛的核型多态性，我国的泥鳅以二倍体和四倍体为主。根据雌核发育结果和细胞遗传学证据推测二倍体泥鳅、四倍体泥鳅和大鳞副泥鳅(二倍体)的性别决定分别为XX-XY型、XXXX-XXXY型和ZW-ZZ型。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种通过种间杂交获得高比例雄性泥鳅的方法，通过该方法可获得高比例的雄性杂交泥鳅。
[0005]上述目的是采用以下技术方案实现的:
[0006]一种通过种间杂交获得高比例雄性泥鳅的方法，该方法是:以雌性大鳞副泥鳅与雄性四倍体泥鳅为亲本进行杂交。
[0007]优选地，所述雌性大鳞副泥鳅与雄性四倍体泥鳅的亲本比例约为4-8:3。
[0008]进一步优选地，所述杂交的方法是:对雌性大鳞副泥鳅、雄性四倍体泥鳅腹腔注射催产药物，催产12-16小时后，采集雄性四倍体泥鳅的精巢和雌性大鳞副泥鳅的卵粒，将精巢与保存液研磨混匀后再与卵粒混匀，得受精卵，将受精卵进行孵化，饲养孵化后获得的杂交泥鳅苗，得到高比例的雄性泥鳅。
[0009]进一步优选地，所述催产药物为促排卵素2号和地欧酮。
[0010]进一步优选地，所述催产药物的注射剂量为:雌性大鳞副泥鳅注射促排卵素2号35 μ g/kg+地欧酮4mg/kg，雄性四倍体泥鳅减半。
[0011]进一步优选地，所述保存液的配方为:氯化钠7.5g，氯化钾0.3g，氯化钙0.3g，葡萄糖3.0g,双蒸水定容到1000ml。
[0012]本发明的有益效果是:
[0013]1.采用本发明获得的三倍体杂交泥鳅群体，其中雄性杂交泥鳅的比例高达87.64%-98.53%,雌鱼卵巢发育不良。
[0014]2.与现有的方法(如三系配套法)相比，本发明所需要的育种世代数少，通过一代杂交即可获得高比例的雄性泥鳅，同时方法简单、高效、可重复性强；本发明不需要借助激素投喂性反转技术、雌核发育和染色体加倍等技术，也不必借助测交、回交和自交等手段，不存在食品安全问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是利用流式细胞仪对大鳞副泥鳅、四倍体泥鳅和杂交泥鳅的倍性鉴定图谱，参照为二倍体公鸡血；
[0016]图2是杂交泥鳅雌雄成体性腺外观和性腺切片图，图中:A:雄性杂交泥鳅成鱼，黑色箭头指向精巢，白色箭头指向胸轄;B:雄性杂交泥嫩成鱼的精巢；C:杂交泥嫩精巢切片图；D:雌性杂交泥鳅成鱼的卵巢。`【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0018]实施例1
[0019]首先从湖北鄂州市获得健康优良的8尾野生雌性大鳞副泥鳅和6尾雄性四倍体泥鳅为亲本(利用流式细胞仪鉴定亲本倍性)(见附图1)，雌雄鳅亲本比例为4:3。对亲本注射催产药物促排卵素2号(LRH-A2)和地欧酮(D0M)，雌鱼的注射剂量为LRH_A235 μ g/kg+D0M4mg/kg,雄鱼剂量减半，注射方法为腹腔一次注射法。催产药物注射后，将雌雄鱼分开暂养于不同水箱中，水温24-26°C。注射催产药物12-16h后，人工采集精巢，置于研钵中，加入少量的泥鳅精子保存液(保存液配方:氯化钠7.5g，氯化钾0.3g，氯化钙0.3g，葡萄糖
3.0g，双蒸水定容到1000ml)进行充分研磨。制备精液的同时，往擦干的干净小盆中挤入卵粒，一边挤卵一边加入精液，充分混匀精子和卵粒，清水活化受精卵1-2分钟后，再用清水洗涤受精卵2遍，然后将受精卵均匀铺洒于水箱箱底，曝气石增氧，水深为15-20cm，水温25-26°C进行孵化，经过约36h，杂交泥鳅苗完全出膜。杂交泥鳅出膜后约48h (杂交泥鳅苗开口)，开始投喂卤虫饲养，卤虫饲养4天后，开始使用饲料饲养(6d)，杂交泥鳅苗开口 IOd后，随机取1000尾杂交泥鳅苗转入微流水中继续用饲料饲养，直至泥鳅成年。
[0020]随机采集178尾杂交泥鳅(全长为13-18cm)，流式细胞仪检测杂交泥鳅为三倍体(见附图1)。杂交泥鳅的性别利用外观形态观察、内部解剖以及性腺切片观察等方法进行综合鉴定(见表1和附图2)。178尾杂交泥鳅中有156尾为雄性(雄性比为87.64%)，雄性杂交泥鳅的胸鳍鳍条延长呈尖刀状，第二鳍条基部存在突起骨板，精巢发育良好呈管状，精巢切片观察可见精原细胞；22尾为雌性，雌性杂交泥鳅的胸鳍圆滑呈扇形，第二鳍条基部无骨板，卵巢发育不良，质地透明、细小、偶见弥散的发育不成熟的小卵粒。
[0021]表1大鳞副泥鳅早X四倍体泥鳅?杂交子代的性别比例
[0022]
【权利要求】
1.一种通过种间杂交获得高比例雄性泥鳅的方法，其特征在于:以雌性大鳞副泥鳅与雄性四倍体泥鳅为亲本进行杂交。
2.根据权利要求1所述的通过种间杂交获得高比例雄性泥鳅的方法，其特征在于:所述雌性大鳞副泥鳅与雄性四倍体泥鳅的亲本比例为4-8:3。
3.根据权利要求1或2所述的通过种间杂交获得高比例雄性泥鳅的方法，其特征在于:所述杂交的方法是:对雌性大鳞副泥鳅、雄性四倍体泥鳅腹腔注射催产药物，催产12-16小时后，采集雄性四倍体泥鳅的精巢和雌性大鳞副泥鳅的卵粒，将精巢与保存液研磨混匀后再与卵粒混匀，得受精卵，将受精卵进行孵化，饲养孵化后获得的杂交泥鳅苗，得到高比例的雄性泥鳅。
4.根据权利要求3所述的通过种间杂交获得高比例雄性泥鳅的方法，其特征在于:所述催产药物为促排卵素2号和地欧酮。
5.根据权利要求4所述的通过种间杂交获得高比例雄性泥鳅的方法，其特征在于:所述催产药物的注射剂量为:雌性大鳞副泥鳅注射促排卵素2号35 μ g/kg+地欧酮4mg/kg，雄性四倍体泥鳅减半。
6.根据权利要求3所述的通过种间杂交获得高比例雄性泥鳅的方法，其特征在于:所述保存液的配方为:氯化钠7.5g，氯化钾0.3g，氯化钙0.3g，葡萄糖3.0g,双蒸水定容到1000m l0
【文档编号】A01K61/00GK103875569SQ201410111329
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】曹小娟, 王卫民, 黄松钱, 高坚, 田先畅 申请人:华中农业大学