利用水杨酸诱导铁皮石斛生产石斛多糖的方法
【专利摘要】本发明提供一种利用水杨酸诱导铁皮石斛生产石斛多糖的方法，采用如下步骤：(1)铁皮石斛种子播撒于1/2MS培养基表面，在温度23～25℃，光照强度1500～1700lx，光暗比为10h/14h条件下进行培养，获得诱导培养的铁皮石斛组培苗；(2)用0.1％的无水乙醇溶液溶解水杨酸，配制成浓度为5mmol/L的水杨酸母液。将水杨酸母液添加到1/2MS培养基中至水杨酸终浓度为98～102μmol/L；然后将石斛组培苗转苗到上述添加了水杨酸的1/2MS培养基，在26～28℃、相对湿度66～68％、光强1800～2000lx、光暗比为12h/12h条件下培养29～31天。本发明在组织培养中通过施加少量的水杨酸，即可大幅提高了铁皮石斛中石斛多糖的积累效率，投资少，效果显著，方便易行。
【专利说明】利用水杨酸诱导铁皮石斛生产石斛多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明提供一种利用水杨酸诱导铁皮石斛生产石斛多糖的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]石斛多糖具有多种药理功效，主要体现在调节机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、降血糖和抗白内障等方面。但由于铁皮石斛在自然条件下繁殖率低、生长缓慢、且被过度采挖利用。此外，由于生态环境的破坏，导致野生资源濒临灭绝。这都限制了石斛多糖生产和进一步开发利用。石斛组织培养物在多糖含量、多糖的单糖化学组成及作用等方面与天然野生品存在着极大的相似性，以组织培养物替代原药材或者生产有效成分成为解决石斛资源短缺的方法之一，但依然无法解决石斛多糖药源紧缺的问题。
[0003]目前，国内市场上已经有一些提高铁皮石斛多糖产量的相关技术，如浙江农林大学的“一种提高铁皮石斛多糖含量的栽培方法”(CN201210096652.0)，在红光或红光和蓝光的混光条件下栽培铁皮石斛，来提高铁皮石斛的多糖含量。浙江农林大学的“一种提高铁皮石斛多糖的方法”(CN201110044537.4)，通过改善栽培条件以及声波刺激以达到提高铁皮石斛多糖的目的。关于铁皮石斛积累多糖的诱导因子，上述相关技术都集中在物理因子调节方面，并且需要光、声发生器等设施，技术工艺比较复杂，这无疑增加了生产成本和技术推广的难度。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种能够克服现有技术中存在的缺陷，技术工艺简单易行、廉价高效且能显著提高铁皮石斛生产石斛多糖效率的利用水杨酸诱导铁皮石斛快速生产石斛多糖的方法。其具体的技术方案为:
[0005]利用水杨酸诱导铁皮石斛生产石斛多糖的方法，其特征在于采用如下步骤:
[0006](I)制备铁皮石斛组培苗:铁皮石斛种子播撒于1/2MS培养基表面，在温度23~25°C，光照强度1500~17001x，光暗比为10h/14h条件下培养至苗高3~4cm，获得诱导培养的铁皮石斛组培苗；
[0007](2)诱导铁皮石斛的多糖积累:用0.1 %的无水乙醇溶液溶解水杨酸，配制成浓度为5mmol/L的水杨酸母液,将水杨酸母液添加到1/2MS培养基中至水杨酸终浓度为98~102ymol/L ;然后将石斛组培苗转苗到上述添加了水杨酸母液的1/2MS培养基，在26~28°C、相对湿度66~68%、光强1800~20001x、光暗比为12h/12h条件下培养29~31天。
[0008]所述利用水杨酸诱导铁皮石斛生产石斛多糖的方法，其特征在于:步骤(1)中，铁皮石斛采用浙江雁荡山铁皮石斛，采用添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基，石斛种子采用浙江雁荡山铁皮石斛种子。
[0009]本发明与现有技术相比，其优点是:在组织培养中施加了少量的水杨酸，大幅提高了铁皮石斛中石斛多糖的积累效率，具有投资少、效果显著、方便易行的特点，对于降低石斛多糖的生产成本、满足石斛多糖的大规模生产具有重要意义。
【具体实施方式】
[0010]实施例1:
[0011]步骤1、制备铁皮石斛组培苗:选用采用浙江雁荡山铁皮石斛种子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基表面，在温度23°C，光照强度15001x，光暗比为10h/14h条件下让种胚分化成芽。日光灯下培养至铁皮石斛无菌苗高度约3~4cm，即获得诱导培养的铁皮石斛无菌苗。
[0012]步骤2、诱导铁皮石斛积累石斛多糖:水杨酸采用美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司生产的水杨酸。先用0.1 %的无水乙醇溶液溶解水杨酸,配制成浓度为5mmol/L的水杨酸母液,将水杨酸母液添加到含30g/L鹿糖的1/2MS培养基中，至水杨酸终浓度为98 μ mol/L，然后将石斛组培苗转苗到上述添加了水杨酸母液的1/2MS培养基，与空白对照组同时在26 °C、相对湿度66 %、光强18001X、光暗比为12h/12h条件下培养31天。
[0013]实施例2:
[0014]步骤1、制备铁皮石斛组培苗:选用采用浙江雁荡山铁皮石斛种子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基表面，在温度24°C，光照强度16001x，光暗比为10h/14h条件下让种胚分化成芽。日光灯下培养至铁皮石斛无菌苗高度约3~4cm，即获得诱导培养的铁皮石斛无菌苗。
[0015]步骤2、诱导铁皮石斛积累石斛多糖:水杨酸采用美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司生产的水杨酸。先用0.1 %的无水乙醇溶液溶解水杨酸,配制成浓度为5mmol/L的水杨酸母液,将水杨酸母液添加到含30g/L鹿糖的1/2MS培养基中，至水杨酸终浓度为100 μ mol/L，然后将石斛组培苗转苗到上述添加了水杨酸母液的1/2MS培养基，与空白对照组同时在27°C、相对湿度67%、光强19001x、光暗比为12h/12h条件下培养30天。
[0016]实施例3:
[0017]步骤1、制备铁皮石斛组培苗:选用采用浙江雁荡山铁皮石斛种子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基表面，在温度25°C，光照强度17001x，光暗比为10h/14h条件下让种胚分化成芽。日光灯下培养至铁皮石斛无菌苗高度约3~4cm，获得诱导培养的铁皮石斛无菌苗。
[0018]步骤2、诱导铁皮石斛积累石斛多糖:水杨酸采用美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司生产的水杨酸。先用0.1 %的无水乙醇溶液溶解水杨酸,配制成浓度为10mmol/L的水杨酸母液，将水杨酸母液添加到含30g/L蔗糖的1/2MS培养基中，至水杨酸终浓度为102 μ mol/L，然后将石斛组培苗转苗到上述添加了水杨酸母液的1/2MS培养基，与空白对照组同时在28°C、相对湿度68%、光强20001x、光暗比为12h/12h条件下培养29天。
[0019]采用以下方法对本发明中水杨酸诱导的铁皮石斛组培苗及空白对照组定期进行观察和检测，具体是每天取少量铁皮石斛样品按以下步骤对本发明水杨酸诱导的铁皮石斛及空白对照组中的石斛多糖含量进行提取测定:①精确称取5g铁皮石斛苗，80°C杀青30分钟，60°C下烘干至恒重。磨成石斛粉(40目)，加入石油醚(按固液比1: 10)，回流比，重复3次，脱脂后的石斛粉溶于50°C温水，加0.5%已活化的纤维素酶液(pH值为5)，恒温酶解1.5h 升温至90°C灭活纤维素酶，迅速冷却并过滤；滤渣加入90%酒精浸提lh，过滤所得滤渣加入水溶解，磁力搅拌器搅拌，常温下浸提两次，每次lh，过滤。加入无水乙醇，使体系乙醇浓度达到80% (体积比)。在冰箱中静置5天，过滤，滤渣经真空干燥得石斛多糖称取在105°C下干燥至恒重的葡萄糖0.010g，配制成浓度为100mg/L的标准溶液，将葡萄糖标准溶液稀释至不同浓度，绘制标准曲线，得线性回归方程；④准确吸取样品测定液2mL,置于IOmL试管中,加入苯酹溶液ImL,润旋混匀,冰浴5min,加5mL浓硫酸,混匀,沸水浴15min。取出试管，流水冷却至室温，在490nm波长下测定其吸光值；⑤记录测得的吸光值，通过线性方程计算样品葡萄糖浓度，按公式计算石斛多糖含量(％) =LXDXfXV/W计算出多糖含量，其中L (mg/ml)表示样品液中葡萄糖的浓度，D表示样品液的稀释因素，f表示换算因素，V(ml)表示供试液的体积，W(mg)表示石斛重量。
[0020]结果表明:本发明中用水杨酸处理的铁皮石斛苗中所检测的石斛多糖含量相比于对照组显著提高，处理后铁皮石斛苗石斛多糖的平均含量达到32.69~36.28%，是对照的
1.71 ~1.9 倍。
【权利要求】
1.一种利用水杨酸诱导铁皮石斛生产石斛多糖的方法，其特征在于采用如下步骤: (1)制备铁皮石斛组培苗:铁皮石斛种子播撒于1/2MS培养基表面，在温度23~25°C，光照强度1500~17001x，光暗比为10h/14h条件下进行培养，获得诱导培养的铁皮石斛组培苗； (2)诱导铁皮石斛的多糖积累:用0.1 %的无水乙醇溶液溶解水杨酸，配制成浓度为5mmol/L的水杨酸母液,将水杨酸母液添加到1/2MS培养基中至水杨酸终浓度为98~102ymol/L ;然后将石斛组培苗转苗到上述添加了水杨酸母液的1/2MS培养基，在26~28°C、相对湿度66~68%、光强1800~20001x、光暗比为12h/12h条件下进行培养，培养29~31天。
2.根据权利要求1所述的利用水杨酸诱导铁皮石斛生产石斛多糖的方法，其特征在于:步骤(1)中，采用添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基，石斛种子采用浙江雁荡山铁皮石斛种子。
【文档编号】A01H4/00GK104012414SQ201410276836
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】张建勇, 袁佐清, 刘涛, 丛高远 申请人:山东理工大学