一种利用二倍体细胞与花粉细胞融合育种法培育三倍体霍山石斛的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用二倍体细胞与花粉细胞融合育种法培育三倍体霍山石斛的方法。该方法包括：(1)优选出抗逆性好、生长快、茎秆粗、茎高长、分蘖多、纤维含量低、药效成分含量高的不同产地的霍山石斛品种作为三倍体培育源植株亲本；(2)对源植株种子在固体培养基中进行无菌播种，获得原球茎；(3)对源植株花粉在固体培养基中进行无菌培养，获得花粉细胞群；(4)制备花粉细胞和原球茎细胞的原生质体，进行细胞融合；(5)在固体培养基上对融合细胞进行培养分化成幼株，检测出三倍体植株；(6)对三倍体植株进行组培，获得大量三倍体幼苗。
【专利说明】一种利用二倍体细胞与花粉细胞融合育种法培育三倍体霍山石斛的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及兰科石斛属药用植物生物育种方法，特别涉及一种利用二倍体细胞与花粉细胞融合育种法培育三倍体霍山石斛的方法。
【背景技术】
[0002]霍山石斛(学名:Dendrobiumhuoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng) 在国际上有“药界大熊猫”之称的野生霍山石斛，史称霍石斛，俗称米斛，距今已有200
多年的历史。原产于我国安徽大别山等地，是国家现代中药重大专项200多个濒危稀缺品种中首位保护品种。是药用石斛中的极品，也是霍山县独有的、拥有原产地地理标志的名贵中药材，历史上被誉为“中华九大仙草之首”、“健康软黄金”。《神农本草》、《本草纲目》均有记载。霍山石斛所含有的多糖、生物碱类物质有清咽利嗓，保肝明目、降糖降脂、延年益寿之功效。本品能大幅度提高人体内SOD(延缓衰老的主要物质)，在增强免疫力、抗疲劳、延缓衰老和促进癌细胞凋亡等方面有明显作用，从而达到保健保健的功效。
[0003]多倍体育种是植物新品种培育的重要手段，多倍体育种起源于20世纪初，现在已广泛应用于植物新品种的培育中。多倍体由于基因组倍性的增加，往往表现出形态上的巨大性和抗性增强等特点。其中三倍体还具有不育特点，即可作为永久杂种，也有利于商业保护。
[0004]通过基因组三倍化，可以获得具有多倍体和杂交种双重优势的三倍体，其优势表现出具有巨大性和不可替代性，可以提高霍山石斛药材产量、品质和抗逆性。三倍体霍山石斛则具有产量和质量上的双重优势。
[0005]国家“十一五”和“十二五”计划均提出“种质资源的挖掘、保存、创新和新品种的定向培育”的任务。为贯彻、落实这项任务，我们倡导应用“基因组多倍化与融合杂交相结合”的方法，实现种质资源的创新和新品种的定向培育的目的。目前仅有三倍体铁皮石斛和春石斛兰的培育方法已公开并授权，迄今为止，三倍体霍山石斛(染色体核型指数为2n=3x=57)及培育方法还未见有公开报道。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种利用二倍体细胞与花粉细胞融合育种法培育三倍体霍山石斛的方法，该方法培育出的三倍体霍山石斛与二倍体霍山石斛相比，其主要形态性状基本相同，但其茎、叶、花表现出明显的增大，产量与多糖含量显著提高，抗逆性增强。本发明产生的三倍体霍山石斛具有多倍体和杂交种的双重优势。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
一种利用二倍体细胞与花粉细胞融合育种法培育三倍体霍山石斛的方法，包括以下步骤:
步骤(I)中所述霍山石斛为分布在大别山山系的不同产地具有优良性状的品种，其中高纬度、高海拔地区的品种具有抗逆性强、茎杆粗、药效成分含量高的特点，低纬度、低海拔地区的品种具有生长速度快、茎高长、分蘖多、纤维含量低的特点。
[0008]步骤(2)和步骤(3)中所述培养为固体培养基培养，适合脱分化形成愈伤组织的培养基均可。优选大量元素减半的1/2MS培养基，调整蔗糖浓度为5%-8%，优选添加10-15%的椰乳，2，4-D 0.2-2.0 mg/L, NAA 0.2-2.0 mg/L ;培养温度在25_18°C的昼夜温差范围内，光照时间10-12小时，光照强度2000-3000Lux，色温在4500_5500k。
[0009]步骤(4)中所述原生质体的制备方法为常规的酶解法制备，细胞融合办法优选电击融合法。对花粉细胞和原球茎细胞的原生质体进行细胞融合，是为短时期内获得杂交种而设计的办法。如果利用四倍体植株与二倍体植株开花授粉，再组培成幼苗完成三倍体大量制备，最快需要2年，因为四倍体植株从组培苗到正常开花至少需要I年，从授粉到结实，需要5个月，种子培养成幼苗需要6-8个月。而三倍体融合细胞在验证成功后，再培养成幼苗只需要6-8个月，大大缩短了育苗周期。
[0010]步骤(5)中所述检测染色体倍数采用常规染色镜检办法，选取染色体数目2n=3x=57的幼苗，是培育成功的三倍体，在检测过程中会发现二倍体或四倍体，这些分别是花粉细胞或体细胞融合形成的。
[0011]本发明包括上述任何一项培育方法得到的三倍体霍山石斛。
[0012]本发明有益效果:
本方法先分别培养霍山石斛种子和霍山石斛花粉形成愈伤组织，再分别制备愈伤组织的原生质体，经原生质体融合形成三倍体。该三倍体霍山石斛培育方法步骤简单，能显著缩短育种时间。由这种方法培育出的三倍体霍山石斛与二倍体霍山石斛石斛相比，其主要形态性状基本相同，但其茎、叶、花表现出明显的增大，产量与多糖含量显著提高，抗逆性增强，具有多倍体和杂交种的双重优势。
【具体实施方式】
[0013]下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例，本领域的技术人员对本
【发明内容】
的技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
[0014]为方便描述，以下实施例中用“品种A”表示高纬度、高海拔地区的染色体核型指数为2n=2x=38的霍山石斛品种，该品种具有抗逆性强、茎杆粗、药效成分含量高的特点；用“品种B”表示低纬度、低海拔地区的染色体核型指数为2n=2x=38的霍山石斛品种，该品种具有生长速度快、茎高长、分蘖多、纤维含量低的特点。
[0015]实施例1
(1)将品种A和品种B的植株按常规方法种植栽培；
(2)对上述品种A的种子在固体培养基中进行无菌播种，获得原球茎的愈伤组织，固体培养基为大量元素减半的1/2MS培养基，添加0.2g/L 2，4-D和0.2g/L NAA,调整蔗糖浓度为5%-8%，添加10-15%的椰乳，培养温度在25-18 V的昼夜温差范围内，光照时间10-12 h，光照强度 2000-3000 Lux，色温在 4500-5500 K ；
(3)对上述品种B的花粉在固体培养基中进行无菌培养，获得花粉细胞群，固体培养基为H培养基，添加0.5g/L 2，4-0和1.5 g/L NAA,培养温度在25-18 1:的昼夜温差范围内，光照时间10-12 h，光照强度2000-3000 Lux，色温在4500-5500 K ；
(4)制备花粉细胞和原球茎细胞的原生质体，进行细胞融合，原生质体的制备方法为酶解法制备，细胞融合办法采用电击法；
(5)在固体培养基上对融合细胞进行培养分化成幼株，检测出三倍体植株，取细胞组织染色压片，镜检验证染色体倍数，选取染色体数目2n=3x=57的幼苗，是培育成功的三倍体；
(6)对三倍体植株进行无性组培，获得大量三倍体幼苗，幼苗培育成成株，成株具有抗逆性强、茎杆粗、茎高长、分蘖多、生长速度快、纤维含量低、药效成分含量高的特点，其中总多糖含量达21%。
[0016] 实施例2
(1)将品种A和品种B的植株按常规方法种植栽培；
(2)对上述品种B的种子在固体培养基中进行无菌播种，获得原球茎的愈伤组织，固体培养基为大量元素减半的1/2MS培养基，添加0.2g/L 2，4-D和0.2g/L NAA,调整蔗糖浓度为5%-8%，添加10-15%的土豆汁，培养温度在25-18 °C的昼夜温差范围内，光照时间10-12h，光照强度 2000-3000 Lux，色温在 4500-5500 K ；
(3)对上述品种A的花粉在固体培养基中进行无菌培养，获得花粉细胞群，固体培养基为H培养基，添加0.5g/L 2，4-0和1.5 g/L NAA,培养温度在25-18 1:的昼夜温差范围内，光照时间10-12 h，光照强度2000-3000 Lux，色温在4500-5500 K ；
(4)制备花粉细胞和原球茎细胞的原生质体，进行细胞融合，原生质体的制备方法为酶解法制备，细胞融合办法采用电击法；
(5)在固体培养基上对融合细胞进行培养分化成幼株，检测出三倍体植株，取细胞组织染色压片，镜检验证染色体倍数，选取染色体数目2n=3x=57的幼苗，是培育成功的三倍体；
(6)对三倍体植株进行无性组培，获得大量三倍体幼苗，幼苗培育成成株，成株具有抗逆性强、茎杆粗、茎高长、分蘖多、生长速度快、纤维含量低、药效成分含量高的特点，其中总多糖含量达20%。
【权利要求】
1.一种利用二倍体细胞与花粉细胞融合育种法培育三倍体霍山石斛的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)优选出抗逆性好、株型大、生长快、药效成分含量高的不同产地的霍山石斛品种作为二倍体培育源植株； (2)对源植株种子在固体培养基中进行无菌播种，获得原球茎； (3)对源植株花粉在固体培养基中进行无菌培养，获得花粉细胞群； (4)制备花粉细胞和原球茎细胞的原生质体，进行细胞融合； (5)在固体培养基上对融合细胞进行培养分化成幼株，检测出三倍体植株； (6)对三倍体植株进行无性组培，获得大量三倍体幼苗。
2.按照权利要求1所述的利用二倍体细胞与花粉细胞融合育种法培育三倍体霍山石斛的方法，其特征在于:步骤(I)中所述霍山石斛为分布在大别山山系的不同产地具有优良性状的品种，其中高纬度、高海拔地区的品种具有抗逆性强、茎杆粗、药效成分含量高的特点，低纬度、低海拔地区的品种具有生长速度快、茎高长、分蘖多、纤维含量低的特点。
3.按照权利要求1所述的利用二倍体细胞与花粉细胞融合育种法培育三倍体霍山石斛的方法，其特征在于:步骤(2)和步骤(3)中所述培养为固体培养基，适合诱导愈伤组织的培养基均可，优选大量元素减半的1/2MS培养基，调整蔗糖浓度为5%-8%，优选添加10-15% 的椰乳，2，4-D 0.2-2.0 mg/L, NAA 0.2-2.0 mg/L ;培养温度在 25_18°C 的昼夜温差范围内，光照时间10-12小时，光照强度2000-3000Lux，色温在4500_5500k。
4.按照权利要求1所述的利用二倍体细胞与花粉细胞融合育种法培育三倍体霍山石斛的方法，其特征在于:步骤(4)中所述原生质体的制备方法优选酶解法制备，原生质体融合办法优选电击融合法。
5.按照权利要求1所述的一种三倍体霍山石斛的培育方法，其特征在于:步骤(5)中所述检测染色体倍数采用常规染色镜检办法，选取染色体数目2n=3x=57的幼苗，是培育成功的三倍体。
6.权利要求1-5中任何一项所述培育方法得到的三倍体霍山石斛。
【文档编号】A01H4/00GK104429939SQ201410343440
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】邓辉, 姚厚军, 张德华, 杨国栋, 陈乃东 申请人:皖西学院