公丁香提取物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种公丁香提取物，由下述步骤制备：(1)将公丁香叶片于40～65℃烘干，粉碎；(2)按质量体积比1∶3～9加入95％的乙醇，微波处理同时500～600W电加热70～120s，过滤得滤液；(3)按质量体积比1∶3～9加入95％的乙醇，浸泡4～6d，过滤得滤液；(4)按质量体积比1∶3～9加入95％的乙醇，功率为500～650W的超声波提取1～1.5h，过滤得滤液；(5)合并步骤(2)、(3)和(4)的滤液，在40～55℃和400～600毫米汞柱下浓缩，得浸膏；及其在防治烟草青枯病方面的应用。本发明能抑制青枯病菌的生长，处理后，青枯菌鞭毛消失破、菌体消解，抑制菌体蛋白合成，降低POD、CAT、SDH酶活。此外，烟草青枯病的温室和田间防效分别达到71.5％和59.7％，具有较大应用价值。
【专利说明】公丁香提取物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物病害生物防治【技术领域】，尤其是一种公丁香提取物，及其应用。
【背景技术】
[0002] 烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum)引起的典型的土传病 害，是烟草上的主要毁灭性病害之一。近年来，受气候变暖、土壤酸化以及种植制度（连作） 等因素影响，发生范围、危害程度逐年加重，成为制约福建、湖北、重庆、湖南、云南、四川等 烟区的烤烟种植的主要限制因素之一。由于生产上基本无优质抗病的烟草品种可利用，针 对烟草青枯病的防治主要以农用硫酸链霉素防治为主，防治效果不理想，且由于使用年限 较长，防治效果下降趋势明显。生物防治也是近年来人们努力的方向，筛选了大量的生防微 生物，由于微生物容易受环境条件影响，防治效果差且不稳定。植物源农药，就是直接利用 或提取植物的根、茎、叶、花、果、种子等或利用其次生代谢物质制成具有杀虫或杀菌作用的 活性物质。植物被认为是化学合成杀菌剂最好的替代品，尤其是药用植物更具有开发为植 物源杀菌剂的巨大潜力。
[0003]利用中药材提取物进行病害防治的相关研究报道也越来越多。Amadioha等发现 苦楝树种子的提取物对稻瘟病菌表现出良好的防治效果，可与多菌灵相媲美。姜雯婷等测 定52种热带药用植物对烟草青枯病菌的抑菌圈直径和最小抑菌浓度，发现 13种热带药用 植物对烟草青枯菌具有抑制作用。相较于生防微生物，植物源抗菌物质除了具有天然无公 害的优势外，其制备条件和防治效果更为稳定，因此具有重要应用前景，但上述植物源抗菌 物质的来源少，获取成本较高。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有技术的不足，提出一种公丁香提取物，获取方便，操作简单。
[0005]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种公丁香提取物，由下述步 骤制备：
[0006] (1)、将公丁香叶片于40?65°C烘干，粉碎；
[0007] (2)、按质量体积比1 : 3?9加入95%的乙醇，微波处理同时500?600W电加热 70?120s，过滤得滤液；
[000S] (3)、按质5体积比1 : 3?9加入的乙醇，浸泡4?6d，过滤得滤液；
[0009] (4)、按质量体积比1 : 3?9加入95%的乙醇，功率为500?650W的超声波提取 1?1.5h，过滤得滤液；
[0010] (5)、合并步骤⑵、⑶和⑷的滤液，在40?55?和400?600毫米汞柱下浓 缩，得浸膏。
[0011]优选的，步骤（1)中粉碎后过孔径〇.425麵的筛。
[0012]优选的，步骤（1)烘干米用的是电热恒温鼓风干燥箱。
[0013]优选的，步骤（5)中浓缩米用的是旋转蒸发仪。
[0014] 本发明还提供如上所述公丁香提取物在防治烟草青枯病方面的应用。
[0015] 优选的，在烟草青枯病发病初期施用公丁香提取物。
[0016] 优选的，将公丁香提取物稀释400倍，每间隔7?10天施用，连续2?3次。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：公丁香提取物能抑制青枯病菌的生长，处 理后，青枯菌鞭毛消失破、菌体消解，抑制菌体蛋白合成，降低POD、CAT、SDH酶活。经鉴定， 该提取物主要活性成分为丁香酚和乙酸丁香酚酯。此外，烟草青枯病的温室和田间防效分 别达到71. 5%和59. 7%，具有较大应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为正常烟草青枯菌透射电镜下的观察结果；
[0019] 图2为经公丁香提取物处理过的烟草青枯病菌在透射电镜下的观察结果；
[0020] 图3为电泳比较图；
[0021] 图4为公丁香提取液进行GC-MS分析鉴定的总离子流图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不 应对本发明的保护范围有任何的限制作用。
[0023] 实施例1抗青枯病菌中药材筛选 [0024] 1. 1 材料
[0025]自北京同仁堂青岛分店购买的40种中药材，见表1，筛选出抗青枯病菌的药材。 [0026] 供试菌株：致病性青枯病原菌由中国农业科学院烟草研究所从烟田采集感染病株 分离纯化获得。
[0027] 培养基：牛肉膏蛋白胨固体和液体培养基（NA培养基）、燕麦培养基、马铃薯葡萄 糖琼脂培养基（PDA培养基）
[0028] 1· 2药材提取液的制备
[0029] 将所购买的40种植物阴干，置于50°C电热恒温鼓风干燥箱中烘千，粉碎机粉碎后 过0· 425臟筛。称取50. 0g植物干粉于500mL三角瓶，加入95%乙醇300mL微波萃取法 (微波炉调至中火，9〇s)，过滤并收集提取液，再加入300mL95%乙醇冷浸5d,过滤并收集提 取液，再次加入300mL 95%乙醇，超声波（功率为600W)提取lh，过滤并收集提取液，合并 提取液，在50°C下用旋转蒸发仪减压浓缩至干，回收溶剂，所得浸膏用甲醇定容为质量浓度 l〇〇g/L的溶液，获药材提取液，置于4°C保存备用。
[0030] 1. 3烟草青枯病菌拮抗实验
[0031]菌悬液制备。将烟草青枯菌用接种环将菌株接种于装有NA液体培养基的三角瓶 中，30°C恒温摇床中培养24h，振动频率120r/min。加入无菌生理水，稀释成浓度为108CFU/ mL的菌液。
[0032]抑菌试验采用牛津杯法进行测定。将熔化的NA培养基冷却至约5(TC，每100mL ΝΑ培养基中加入lmL病原菌菌悬液（lOSCFU/mL)，充分摇匀后制备带有病原菌的平板。待 培养基凝固后用镊子将无菌的牛津杯（8mm)轻轻放入培养皿中，在水平放置的平皿中均匀 地放置3只牛津杯。同时吸取150 μ L药材提取液加入牛津杯中，每处理3次重复。对照加 ^寸里鴨。平板于超净I：作台内放置4h以贿大部分麵扩散纖脂中，之后将平板于 置30°c恒温培养箱培养48h后用十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0033] 1.4试验结果如表1所示。
[0034] 表1四十种药材提取液对烟草青枯病菌、黑胫病菌及赤星病菌的抑菌作用结果
[0035]
【权利要求】
1. 一种公丁香提取物，由下述步骤制备： (1) 、将公丁香叶片于40?65°C烘干，粉碎； (2) 、按质量体积比1 : 3?9加入95%的乙醇，微波处理同时500?600W电加热70? 120s，过滤得滤液； (3) 、按质量体积比1 : 3?9加入95%的乙醇，浸泡4?6d，过滤得滤液； (4) 、按质量体积比1 : 3?9加入95%的乙醇，功率为500?650W的超声波提取1? 1.5h，过滤得滤液； (5) 、合并步骤（2)、⑶和⑷的滤液，在40?55°C和400?600毫米汞柱下浓缩，得 浸膏。
2. 如权利要求1所述公丁香提取物，其特征在于：步骤（1)中粉碎后过孔径0.425mm的 筛。
3. 如权利要求1所述公丁香提取物，其特征在于：步骤（1)烘干采用的是电热恒温鼓 风干燥箱。
4. 如权利要求1所述公丁香提取物，其特征在于：步骤（5)中浓缩采用的是旋转蒸发 仪。
5. 如权利要求1所述公丁香提取物在防治烟草青枯病方面的应用。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于：在烟草青枯病发病初期施用公丁香提取物。
7. 如权利要求5或6所述的应用，其特征在于：将公丁香提取物稀释400倍，每间隔 7?10天施用，连续2?3次。
【文档编号】A01N65/28GK104247719SQ201410348099
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】林勇, 孔凡玉, 徐茜, 戴培刚, 陈志厚, 张成省, 徐辰生, 夏艳, 冯超, 王静, 韩腾, 董瑜 申请人:福建省烟草公司南平市公司, 中国农业科学院烟草研究所