专利名称：丁香叶或其提取物在制备抗猪流感病毒药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及丁香叶提取物的的一种新的药理用途，尤其涉及丁香叶或其提取物在制备抗猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)药物中的用途,属于丁香叶或其提取物的药理用途领域。
背景技术：
猪流感(Swineinfluenza, SI)是由 A 型流感病毒(Swine influenza virus, SIV)引起的一种猪的急性呼吸道传染病。SIV不仅危害猪的健康和养猪业，而且在流感病毒的遗传进化和生态分布中占有重要地位，特别是对人类健康具有极大威胁。
丁香叶为木犀科丁香属植物紫丁香Syringa oblata Lindl、朝鲜丁香Syringadiatata Nakai或洋丁香Syringa vulgaris L的干燥叶。丁香叶性寒、味苦，归肺、胃经，具有清热解毒，消炎止痢之功效，用于急性菌痢，肠炎及上呼吸道感染，咽喉肿痛，急慢性扁桃体炎等细菌感染性疾病。迄今为止，尚未见有关丁香叶对流感病毒有预防或治疗作用的研究报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供丁香叶或其提取物的一种新的药理用途。本发明通过体外和体内抗抗猪流感病毒实验发现，丁香叶或其提取物对猪流感病毒具有显著的预防及治疗作用，能将其制备成预防或治疗猪流感病毒的药物。本发明首先测定了丁香叶提取物体外抗猪流感病毒的作用，实验结果表明，不同浓度的丁香叶提取物对于猪流感病毒均有显著的预防作用、治疗作用、抗吸附作用及直接灭活作用，随着丁香叶提取物浓度的提高，其抗猪流感病毒的作用也随之增强。在体外抗病毒实验的基础上，本发明进行了丁香叶提取物体内抗猪流感病毒实验。肺脏病毒滴定结果表明，丁香叶提取物高剂量组的病毒滴度与阳性药物对照(盐酸金刚烷胺)的病毒滴度相比，差异不显著。丁香叶提取物对小鼠肺炎的抑制作用显示，丁香叶提取物的高、中剂量组的肺指数及肺指数抑制率与阳性药物(盐酸金刚烷胺)组相比差异不显著，而且这三组与正常对照组相比，差异也不显著。肺病变程度的结果表明(表3)，丁香叶乙醇提取物的高、中剂量组与阳性药物(盐酸金刚烷胺)组相比差异不显著，说明丁香叶提取物可减轻小鼠流感病毒所致肺炎的病变程度。本发明中所述的“丁香叶”可以是将丁香叶粉碎研细后所得到的丁香叶细粉；本发明中所述的“丁香叶提取物”可以是按照文献中报道的各种提取方法所制备得到的提取物，包括丁香叶的水提取物或醇提取物，优选为醇提取物；作为参考，本发明所述的“丁香叶提取物”可以是将丁香叶用水或醇类物质进行回流后得到提取物，将提取物过滤、浓缩即得；为了达到更好的效果，进一步，还可以将浓缩液中加入蒸馏水，静置，离心，取上清液用大孔吸附树脂柱色谱进行吸附，水洗后，先后用0 50%乙醇洗脱和50 90%乙醇进行洗脱，收集50 90%乙醇洗脱液，浓缩，即得丁香叶醇提取物。其中，所述的大孔吸附树脂优选为HP-20大孔吸附树脂；所述的醇类物质优选为乙醇或甲醇。由此，本发明还提供了一种预防或治疗猪流感的药物组合物，由由有效量的丁香叶细粉或丁香叶提取物与药学上可接受的载体或辅料组成。本发明所述的“丁香叶细粉或丁香叶提取物”可以加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的赋形剂或载体后，以常规的中药制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂，例如可以是注射剂、口服液、散剂等；其中，所述的辅料可以是抗氧络合剂、填充剂等；所述的药学上可接受的载体是木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、葡聚糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐、氯化钠、葡萄糖酸钙或磷酸钙中的一种或几种。
图I小鼠每天平均体重变化。图2 丁香叶乙醇提取物对感染小鼠肺脏病毒含量影响。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。I.材料与试剂I. I病毒及细胞HlNl亚型猪流感病毒(有关HINI亚型的猪流感病毒的实验需要在国家流感参考实验室完成，本领域普通技术人员在经过领导的批准后均能够在该实验室获得相应的HINI亚型的猪流感病毒并需要在该实验室完成有关的实验)、MDCK细胞购自上海研晶生物科技有限公司。I. 2细胞培养液和维持液细胞培养液为含100U/mL的青霉素100g/mL的链霉素和10%胎牛血清的DMEM培
养液；细胞维持液除含2%胎牛血清外，其它成分同细胞培养液。病毒稀释液为不含血清，含终浓度为2 U g/mL的TPCK-胰酶，其它成分同细胞培养液。I. 3 药物供试药物(I) 丁香叶乙醇提取物(2) 丁香叶水提取物；阳性药物对照盐酸金刚烷胺。I. 4 试剂MTT (3-(4，5_ 二甲基噻唑_2)_2，5_ 二苯基四氮唑溴盐)，MTT以不含血清的DMEM培养基配制成5mg/mL溶液，过滤除菌，-20°C保存；二甲基亚砜(DMSO) ;1%鸡血。I. 5 仪器
超净工作台，超低温冰箱，冷冻离心机，电子分析天平，乙醚，灌胃针，平皿，解剖剪，眼科镊，一次性注射器等。实施例I 丁香叶醇提物的制备将丁香叶粉碎用百分比浓度为50-95%的乙醇进行进行回流提取1-3次，将提取液过滤并浓缩；将浓缩液中加入蒸馏水，静置，离心，取上清液大孔吸附树脂柱色谱进行吸附，水洗后，先后用0 50%乙醇洗脱和50 90%乙醇，收集50 90%乙醇洗脱液，浓缩，即得。实施例2 丁香叶水提物的制备将丁香叶粉碎用水煎煮提取1-3次，将煎煮液过滤，浓缩，即得。
实验例I猪流感病毒感染性的测定实验I、实验方法用病毒稀释液对猪流感病毒进行连续10倍递次稀释，将各稀释度的病毒液接种于单层的MDCK细胞中，IOOii L/孔，每个稀释度平行做8个复孔，同时设正常细胞对照，细胞对照孔不加病毒，只加稀释液，37°C吸附2h后，小心吸弃各孔病毒液换用维持液继续培养，72h后，做血凝试验并记录结果，按Reed-Muench法计算病毒的半数细胞感染量(TCID50)。2、实验结果根据按Reed-Muench法，计算猪流感病毒的TCID50为10-7. 2/0. lmL。实验例2 丁香叶醇提取物对细胞毒性实验I、实验方法将MDCK细胞悬液按100 U L/孔接种于96孔培养板中，放入37°C，5%C02温箱中培养24h，待细胞长满单层后，弃去原培养液。丁香叶醇提取物用细胞维持液2倍连续稀释，浓度分别为 2000 u g/mL, 1000 u g/mL, 500 u g/mL, 250 u g/mL, 125 u g/mL, 63 u g/mL, 32 u g/mL。将不同稀释倍数的丁香叶醇提取物加入细胞培养孔中，每孔100 y L每个浓度重复4孔，同时设细胞对照孔(不加药，只加培养液)，置37°C，5%C O2培养箱内培养72h，每日观察细胞病变并记录。2、实验结果丁香醇提取物对的MDCK细胞的最大无毒浓度为250 U g/mL,在此浓度范围以上时细胞萎缩、空泡或脱落。实验例3 丁香叶水提取物对细胞毒性实验I、实验方法将MDCK细胞悬液按100 U L/孔接种于96孔培养板中，放入37°C，5%C02温箱中培养24h，待细胞长满单层后，弃去原培养液。丁香叶水提取物用细胞维持液2倍连续稀释，浓度分别为 2000 u g/mL, 1000 u g/mL, 500 u g/mL, 250 u g/mL, 125 u g/mL, 63 u g/mL, 32 u g/mL。将不同稀释倍数的丁香叶水提取物加入细胞培养孔中，每孔100 y L每个浓度重复4孔，同时设细胞对照孔(不加药，只加培养液)，置37°C，5%C02培养箱内培养72h，每日观察细胞病变并记录。2、实验结果丁香叶水提物对MDCK细胞的毒性实验结果见表I。表I 丁香叶水提物对MDCK细胞的毒性实验结果
权利要求
1.丁香叶用于制备抗猪流感病毒的药物中的用途。
2.按照权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的丁香叶包括丁香叶细粉或丁香叶提取物。
3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于所述的丁香叶提取物包括丁香叶水提取物或丁香叶醇提取物。
4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于所述丁香叶醇提取物的制备方法包括丁香叶用醇类物质进行加热回流后所提取得到醇提取物。
5.按照权利要求2或4所述的用途，其特征在于所述醇类物质是甲醇或乙醇。
6.按照权利要求4所述的用途，其特征在于，还包括以下步骤将醇提取物过滤、浓缩，得到浓缩液。
7.按照权利要求6所述的用途，其特征在于，还包括以下步骤将浓缩液中加入蒸馏水，静置，离心，取上清液用大孔吸附树脂柱色谱进行吸附，水洗后，先用O 50 %乙醇洗脱，再用50 90%乙醇，收集50 90%乙醇洗脱液，浓缩，即得。
8.一种预防或治疗猪流感的药物组合物，由有效量的丁香叶细粉或丁香叶提取物与药学上可接受的载体或辅料组成。
9.按照权利要求8所述的药物组合物，其特征在于所述的丁香叶提取物是丁香叶醇提取物。
10.按照权利要求8或9所述的药物组合物，其特征在于将其制备成口服制剂或注射制剂。
全文摘要
本发明公开了丁香叶或其提取物在制备抗猪流感病毒药物中的用途。本发明通过体外和体内抗猪流感病毒实验发现，丁香叶或其提取物对猪流感病毒具有显著的预防或治疗作用，能将其制备成预防或治疗猪流感病毒的药物。
文档编号A61K36/61GK102697858SQ201210186698
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者刘静, 吴悦, 李艳华, 李贤贤, 李鹤, 董秀梅, 赵玉莲, 陈雪英, 黄全勇 申请人:东北农业大学