一种大豆组织培养分化苗的生根方法
【专利摘要】本发明涉及一种大豆组织培养分化苗的生根方法，包括以下步骤：（1）分化芽苗的生根诱导：将组织培养苗分化诱导产生若干不定芽簇时，将芽苗切割下来，再接种在培养基上诱导培养，经过生根诱导后移到生根培养基上培养；（2）生根苗的移栽：生根的芽苗由组培瓶转移到被灭菌的草炭土中，加盖塑料地膜保湿保温，然后进行炼苗，炼苗期间使用MS液体培养基，炼苗后的大豆组培苗移送到温室栽植培养。本发明使得根苗的成活率达到100%，为生物技术育种和目标基因的改良提供了支撑，本发明可以应用于通过转基因技术获得大豆转化体植株培育、大豆转化体植株的无性繁殖，以及大豆转化体株系的生物性状的鉴定。
【专利说明】一种大豆组织培养分化苗的生根方法
【技术领域】
[0001]一种大豆组培分化苗的生根方法，具体涉及一种大豆组织培养过程中再生植株分化苗的生根方法，属于植物生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]利用转基因技术进行良种培育是发达国家以及生物技术公司进行的新一轮产业革命，为现代农业和生物技术育种注入了新的活力。抗除草剂的转基因大豆是目前大豆生产的主要品种，品种遍布美国、加拿大、巴西、阿根廷以及南美的诸多国家，培育转基因大豆的重要手段是在大豆组织培养的基础上实施的不定芽的诱导、基因转化以及转化体再生植株芽苗的生根成苗。根据已发表文章的报道，大豆生根是目前大豆基因转化中的重要环节，缺少这一环节，任何获得目标基因的转化体再生植株芽苗都难以生成自交纯合的第二代植株，也就不能在生产上应用。因此，转基因大豆培育所生成的芽苗及其生根方法是解决转基因大豆生产应用的关键所在，这一技术的应用对于实施大豆大规模的转基因品种的培育、转化体植株再生的自交纯化以及田间试验打下了坚实的基础。
[0003]植物细胞具有诱导再生的功能，其特点是在实验室条件下，在固体培养基上通过子叶节或胚芽的诱导形成大量芽原基细胞和不定芽胚，并在继代培养的过程中形成大量的芽苗，再由生根激素的诱导下实现植株再生。生根的芽苗移栽到无菌的草炭土上生长发育成活后就可以自交产生自交一代种子，进而形成品种。在单一细胞诱导形成植株体的过程中需要经过六个重要的环节:激素诱导一愈伤组织形成一不定芽生长一生根诱导——植株再生——移栽成苗。这六个环节的相互联系、相互影响，任何一个环节的缺失或不稳定都会对植株再生的整个过程产生致命的影响，阻滞生物技术育种的研发进程。在这六个环节中，生根诱导对于形成完整的植株至关重要，是芽苗由供给营养生长转向自主营养生长的关键步骤，通过再生植株的自主营养吸收和根毛吸收的养分供应，芽苗才能够健康地生长发育、长成健壮的植株。
[0004]有文献报道表明，在一般条件下，大S.的再生植株芽苗的根发育和根生长比较困难，条件适宜的情况下再生芽苗的生根率不足25% (《生物技术通报》2013年5期)，1990年吉林农业科学院作大豆的原生质体培养获得的再生植株的生根率仅为13.6-24.2%，并结荚开花。2008年天津大学赵清在以大豆为生物反应器实施大豆基因转化的再生植株生根苗的研究中，通过0.2mg/L IBA的MS培养基中的生根率最高仅为85%(天津大学赵清硕士论文“大豆生物反应器表达融合蛋白CTK-LK”)。2013年内蒙古大学胡卫静等人对“大豆下胚轴离体器官发生的研究”中使用0.5 mg/L NAA生根速度快、根较粗，未指出生根率是多少(胡卫静，内蒙古大学学报2013年第3期)，2013年吉林大学孙昕采用MS无机元素加上B5有机元素(附加有MES和0.5mg/L的IBA)进行吉育47大豆的根诱导，20天后单株生根量达到25g，生根率也达到了 100% (孙昕，硕士论文:吉育47大豆子叶节遗传转化体系的建立与优化)，然而其不具有实用性，无法规模化生产，因为33mL的培养基不可能在20天的时间里产生25g生成物。因此，现有技术中，在一定的培养基条件下可以生根，但是生根量比较少、生根率不高。
【发明内容】
[0005]针对上述问题，本发明提供了一种大豆组培分化苗的生根方法。本发明三个重要的技术关键:一是培养基的调配，需要一种含有必要元素的诱导培养基；二是根分化的诱导生长，其特点是诱导根原基的形成与分化；三是生根苗的移栽的培养，让根苗的成活率达到 100%O
[0006]本发明通过以下技术方案实现:
一种大豆组培分化苗的生根方法，包括以下步骤:
1、分化芽苗的生根诱导:将组织培养苗分化诱导产生若干不定芽簇时，将芽高>1.5cm的芽苗切割下来，再接种在MS+0.5mg/L IBA(卩引哚丁酸，Indolebutyric acid)的培养基上诱导培养1-3天，经过生根诱导的芽苗再转移到生根培养基上培养两周就会形成1_3_的根，每个芽苗可以长成2-5条根不等，根的平均长度为2-3cm ；
其中，生根培养基:Β5、2.0-3.0%蔗糖、3mM MES、50_100mg/L天冬氨酰、100mg/L焦谷氨酸、25-50mg/L叶酸，培养基的pH为5.4-5.6，且B5的用量为1/4标准含量(Gamborg B5Basal Medium, G398, PhytoTechnology Laboratories 公司出品)。优选的，生根培养基:Β5、2.5%蔗糖、3mM MES、50mg/L天冬氨酰、100mg/L焦谷氨酸、38mg/L叶酸，培养基的pH为
5.5，且B5的用量为1/4标准含量。
[0007]2、生根苗的移栽成活:生根的芽苗由组培瓶转移到被灭菌的草炭土中，加盖塑料地膜保湿保温，光照强度从lOOOLux开始，然后逐渐增强到2500-3500LUX进行炼苗，炼苗期间使用MS液体培养基，浇水1-2次，每次20-30mL ；2%的普立特肥浇水1_2次，每次20-30mL ;炼苗后的大豆组培苗移送到温室栽植培养。在温室进行诸如株高、开花量、开花期以及叶片舒展度等生物性状的鉴定，上述方法形成的生根苗成活率可以达到100%。所述光照强度从100Lux开始，然后逐渐增强到3000LUX进行炼苗。
[0008]上述组织培养苗分化诱导的方法，包括以下步骤:
使用大豆中熟品种或早熟品种进行组织培养:将发芽后种子的剥离子叶节放置在芽分化培养基上，诱导子叶节形成芽原基的分化，随后在芽生长培养基上形成不定芽，并生长成若干不定芽簇。
[0009]随着芽原基的大量分化，不定芽簇形成大量高低不同的再生芽。由于外源赤霉素GA3的作用，再生芽可以在4周内形成芽高为1.5-3.5cm的芽苗。
[0010]其中，芽分化培养基:B5( Gamborg B5 Basal Medium, G398)、1.0-3.0% 鹿糖、
1.0-3.0mM MES、0.2%凝胶、1.0-3.0 mg/L BAP(6-节基氨基嘌呤，6-Benzylaminopurine),培养基的pH值为5.6-6.0 ;优选的，芽分化培养基:B 5 ( Gamborg B5 BasalMedium, G398)、2.0% 蔗糖、2.0mM MES、0.2% 凝胶、2.0mg/L BAP (6-苄基氨基嘌呤，6-Benzylaminopurine),培养基的 pH 值为 5.8 ；
芽生长培养基:MS、2.0-3.0% 蔗糖、3.0mM MES、1.0mg/L ZT(玉米素)、0.1-0.2mg/L IAA(萘乙酸)、0.1-0.8 mg/L GA3 (赤霉酸)，培养基的pH 5.6-5.8 ;优选的，芽生长培养基:MS、
2.5% 蔗糖、3.0mM MES、1.0mg/L ZT (玉米素)、0.15mg/L IAA (萘乙酸)、0.5 mg/L GA3 (赤霉酸)，培养基的pH 5.7。
[0011]在本发明中，上述组织培养苗分化诱导和生根诱导的培养条件为:培养室温度控制夜间18°c，10小时，白天23°C，光照控制14小时，光照强度范围1000_3500Lux ;优选的，所述光照强度范围1500-3000LUX。
[0012]在本发明中，所述生根苗移栽成活的条件为:培养室温度控制，夜间为14_15°C，12小时，白天为20-25°C，12小时，光照控制为14小时光照，强度为1500-5000Lux。
[0013]本发明中，生根培养基只能使用B5做基础培养基，用量为1/4标准含量。其中有4个重要的辅助因素，3mM MES、50-100mg/L天冬氨酰、100mg/L焦谷氨酸和25-50mg/L叶酸都是必须的，这4个辅助因子的使用使得再生植株苗生根的诱导率可以达到100%。其次，还有分化芽苗的生根诱导过程:即将芽高>1.5cm的芽苗切割下来，接种在MS+0.5mg/L IBA (吲哚丁酸，Indolebutyric acid)的培养基上诱导培养3天,只有经过生根诱导的芽苗再转移到生根培养基上培养才会形成100%的生根率。显然，能够被诱导形成簇生芽苗使该项技术的基本条件，即:要有适宜的条件诱导形成簇生的芽苗，诱导这些芽苗形成芽高>1.5cm的芽苗，需要满足两个培养条件:其一，首先使用芽分化培养基(B 5培养基)的诱导形成簇生芽；其二，再使用芽生长培养基(MS培养基)培育芽高大于1.5cm的芽苗。此外，根诱导及其移栽驯化的培养条件是保障根分化与根生长的外部条件，这个条件要求稳定、持续，不可更改，并能够确保生根苗成活率达到100%。
[0014]本发明是一种应用生物技术手段实施优化的生根技术，通过根组织的诱导形成完整植株的生长发育实现生物技术育种的目的。本发明使得根苗的成活率达到100%,为生物技术育种和目标基因的改良提供了支撑，本发明可以应用于通过转基因技术获得大豆转化体植株培育、大豆转化体植株的无性繁殖，以及大豆转化体株系的生物性状的鉴定。
[0015]本发明中使用的基础培养基:
MS 培养基(mg/L, Murashige, T.& Skoog, F.1962):
硝酸钾 KNO3 (101.11) 1900，硝酸铵 NH4NO3 (80.04) 1650，磷酸二氢钾 KH2PO4(136.09) 170，硫酸镁 MgSO4.7H20 (246.47) 370，氯化钙 CaCl2.2Η20(147.02) 440 ;碘化# KI (166.01) 0.83，硼酸 H3BO3 (61.83) 6.2，硫酸锰 MnSO4.4Η20 (223.01) 22.3，硫酸锌ZnSO4 *7 H2O(287.54)8.6，钥酸钠Na2MoO4.2Η20 (241.95)0.25，硫酸铜CuSO4.5 H2OC249.68)0.025，氯化钴 CoCl2.6Η20 (237.93)0.025 ;乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA (372.25)37.3，硫酸亚铁FeSO4.7Η20 (278.03) 27.8 ;肌醇100，甘氨酸2，盐酸硫胺素VBl 0.1，盐酸吡哆醇 VB6 0.5,烟酸 0.5,鹿糖 sucrose (342.31) 30g/L,琼脂 agar 7 g/L。
[0016]B5 培养基(mg/L, Gamborg 0L, Miller RA, Ojima K.1968):
硝酸钾 KNO3 (101.11) 2500，氯化钙 CaCl2.2H20(147.02) 150 ;硫酸镁 MgSO4.7H20(246.47) 250，硫酸铵(NH4)2SO4 134 ;碘化钾KI (166.01) 0.75，硼酸H3BO3 (61.83) 3.0，硫酸锰 MnSO4.4Η20 (223.01) 10.0，硫酸锌 ZnSO4.7Η20 (287.54) 2.0，钥酸钠 Na2MoO4.2 H2O(241.95)0.25，硫酸铜 CuSO4.5Η20 (249.68 ) 0.025，氯化钴 CoCl2.6Η20 (237.93) 0.025 ；乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA (372.25) 37.3，硫酸亚铁 FeSO4.7Η20 (278.03);肌醇 100，盐酸硫胺素VBl 10.0，盐酸吡哆醇VB6 1.0，烟酸0.5，蔗糖sucrose (342.31) 30g/L，琼脂agar 7g/L0
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为在芽分化培养基上诱导形成的不定芽；
图2为在芽生长培养基上诱导形成的不定芽簇；
图3为生根培养基上诱导形成的根；
图4为生根培养基中根的发育图。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0019]本发明中所使用的药品均为市购。
[0020]实施例1 一种大豆组培分化苗的生根方法 1、组织培养诱导分化芽:
组织培养和诱导的大豆再生植株的品系是:中熟品种9520和早熟品种211B(青岛农业大学植物基因工程研究所)，这两个品系的共同特点是在芽分化培养基上能够诱导子叶节形成芽原基的分化。
[0021]具体做法是，将大豆种子用次氯酸消毒10分钟，无菌水清洗后，在含有MS液体培养基的滤纸上发芽，当胚根长5mm时，将大豆子叶放置在芽分化培养基上诱导培养30天形成不定芽分化，如图1所示。然后，将不定芽转接在芽生长培养基上，长成若干不定芽簇，诱导形成的不定芽簇如图2所示。其中的芽分化培养基的成分是:以B5作基础培养基、1.0-3.0% 蔗糖辅助 1.0-3.0mM MES,以及 1.0-3.0mg/L 的 BAP 制成，pH 为 5.6-6.0。芽生长培养基的主要成分是以MS作基础培养基、2.0-3.0%蔗糖和3.0mM MES,以及1.0mg/L ZT(玉米素)、0.1-0.2mg/L IAA (吲哚乙酸)、0.1-0.8 mg/L GA3 (赤霉素)制成，pH 为 5.6-5.8。经过两种培养基的诱导，1.0-3.0mg/LBAP的(苄基氨基嘌呤)的范围内均能够诱导形成不定芽，两个品种的不定芽数可以达到20-40个不等，不定芽的诱导率为39.7-97.0%，两个品种在BAP含量不同的培养基中不定芽诱导率如表1所示。
[0022]组织培养苗分化诱导的条件为:培养室温度控制夜间18°C，10小时，白天23°C，光照控制14小时，光照强度范围1000-3500LUX。
[0023]表1两个品种在BAP含量不同的培养基中不定芽诱导率
【权利要求】
1.一种大豆组织培养分化苗的生根方法，包括以下步骤: (1)分化芽苗的生根诱导:将组织培养苗分化诱导产生若干不定芽簇时，将芽高>1.5cm的芽苗切割下来，再接种在MS+0.5mg/L IBA的培养基上诱导培养1_3天，经过生根诱导的芽苗再转移到生根培养基上培养两周就会形成1_3_的根，每个芽苗可以长成2-5条根不等，根的平均长度为2-3cm; 其中， 生根培养基:Β5、2.0-3.0%蔗糖、3mM MES、50_100mg/L天冬氨酰、100mg/L焦谷氨酸、25-50mg/L叶酸，培养基的pH为5.4-5.6，且B5的用量为1/4标准含量； (2)生根苗的移栽:生根的芽苗由组培瓶转移到被灭菌的草炭土中，加盖塑料地膜保湿保温，光照强度从lOOOLux开始，然后逐渐增强到2500-3500LUX进行炼苗，炼苗期间使用MS液体培养基，浇水1-2次，每次20-30mL ；2%的普立特肥浇水1_2次，每次20_30mL ;炼苗后的大豆组培苗移送到温室栽植培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织培养苗分化诱导的方法，包括以下步骤: 使用大豆中熟品种或早熟品种进行组织培养:将发芽后种子的剥离子叶节放置在芽分化培养基上，诱导子叶节形成芽原基的分化，随后在芽生长培养基上形成不定芽，并生长成若干不定芽簇； 其中， 芽分化培养基5、1.0-3.0% 蔗糖、1.0-3.0mM MES、0.2% 凝胶、1.0-3.0 mg/L BAP，培养基的pH值为5.6-6.0 ；
芽生长培养基:MS、2.0-3.0%蔗糖、3.0mM MES、1.0mg/L ZT,0.1-0.2mg/L ΙΑΑ、0.1-0.8mg/L GA3,培养基的 pH 5.6-5.8。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织培养苗分化诱导和生根诱导的培养条件为:培养室温度控制夜间18°C，10小时，白天23°C，光照控制14小时，光照强度范围 1000-3500Lux。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根苗移栽成活的条件为:培养室温度控制，夜间为14-15°C，12小时，白天为20-25°C，12小时，光照控制为14小时光照，强度为 1500-5000Lux。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中生根培养基:B5、2.5%蔗糖、3mM MES、50mg/L天冬氨酰、100mg/L焦谷氨酸、38mg/L叶酸，培养基的pH为5.5，且B5的用量为1/4标准含量。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述光照强度从lOOOLux开始，然后逐渐增强到3000LUX进行炼苗。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述芽分化培养基:B5、2.0%蔗糖、2.0mM MES、0.2% 凝胶、2.0mg/L BAP，培养基的 pH 值为 5.8。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述芽生长培养基:MS、2.5%蔗糖、3.0mMMESU.0mg/L ΖΤ、0.15mg/L ΙΑΑ、0.5 mg/L GA3，培养基的 pH 5.7。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述光照强度范围1500-3000LUX。
【文档编号】A01H4/00GK104126507SQ201410349357
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】姜国勇 申请人:青岛农业大学