发酵大豆萃取物作为吲哚胺2，3双加氧酶抑制剂的应用
【专利说明】发酵大豆萃取物作为吲哚胺2,3双加氧酶抑制剂的应用
[0001] 相关申请案交互参照
[0002] 本申请主张于2014年6月13日申请的第62/011，856号美国临时专利申请案的 优先权，这些全部在此完整并入当成参考。
技术领域
[0003] 本发明关于发酵大豆萃取物作为Π引噪胺2, 3双加氧酶（indoleamine 2, 3-dioxygenase,IDO)抑制剂的用途。
【背景技术】
[0004] 吲哚胺2, 3双加氧酶（ID01或ID0)是一种含有含铁血红素单体蛋白，其催化必需 氨基酸色胺酸（Tryp)的降解。ID0已经被视为是一种赋予有力的免疫调节效应的酵素，以 调节体内的免疫反应，归因于其造成了必需氨基酸色胺酸的分解代谢的酵素活性。ID0调节 的色胺酸分解代谢已经被证实藉由通过多种机转而对T细胞产生效应，包括降低的T细胞 增生、增加的T细胞自妝以及调控T细胞（Tregulatorycells，Tregs)的诱发，其共同导 致细胞免疫反应的损害[1-4]。
【发明内容】
[0005] 本发明非可预期的发现，发酵大豆萃取物有效于抑制吲哚胺2,3双加氧酶的活 性，因而可作为ID0抑制剂。
[0006] 因此，本发明提供发酵大豆萃取物作为ID0抑制剂的应用。
[0007] 具体而言，所述的发酵大豆萃取物是通过以至少一种乳酸菌（例如，乳杆 菌属（Lactobacillusspecies)和可视需要的至少一种酵母菌（例如，酵母菌属 (Saccharomycesspecies))使水溶性大豆萃取物发酵来制得。
[0008] 在部分具体实施例中，发酵后进行一或多个选自由以下组成的群组的步骤：灭 菌、过滤、浓缩、冻干及其任何组合。
[0009] 在特定具体实施例中，该发酵大豆萃取物是通过包含以下步骤的过程来制得：（a) 以至少一种乳酸菌伴随至少一种酵母菌使水溶性大豆萃取物发酵，以形成发酵液；(b)对 该发酵液进行灭菌；（c)过滤经灭菌发酵液；和（d)从经过滤发酵液移除水，以形成浓缩的 发酵大豆萃取物。
[0010] 本发明的各个具体实例的细节说明如后。本发明的其它特征将会经由以下各个具 体实例中的详细说明及权利要求书而清楚呈现。
【附图说明】
[0011] 出于阐释本发明的目的，在图式中显示当前较佳的实施例。然而，应理解，本发明 并不限于所显示的较佳实施例。在图式中：
[0012] 图1中显示MS_20(本发明的发酵大豆萃取物）在人类周边血单核细胞（PBMCs) 抑制干扰素伽玛（IFNγ)诱发的IDO活性。结果来自于η= 6单独实验，数据以平均土标 准偏差的方式呈现，其中（a)显示色氨酸浓度降低（μΜ,Tryp)，（b)犬尿氨酸（kynurenine) 浓度增加（μΜ,kyn)，以及（c)Kyn/Tryp比例（ymol/mmol) 〇
[0013] 图2中显示MS-20以剂量依赖方式在人类周边血单核细胞（PBMCs)抑制IFNγ诱 发的IDO活性，其中（a)为色氨酸浓度（Tryp)，（b)犬尿氨酸浓度（Kyn)，以及（c)为Kyn/ Tryp比例（*103)。这些结果显示MS-20以剂量依赖方式抑制IDO活性，EC5。经计算分别为 0· 71、0· 46 或 0· 48% (1%MS-20 = 4mg/mL)。
[0014] 图3中显示MS-20以剂量依赖方式抑制IFNy诱发的海拉（HeLa)人类子宫颈癌 细胞ID0活性，其中（a)为犬尿氨酸浓度（μΜ,Kyn)及（b)抑制百分比（％ )。这些结果以 平均土标准偏差表示（η= 3独立实验）。
[0015] 图4显示人类周边血单核细胞（PBMCs)的存活率。以0·125% -1%(0·5-4mg/mL) 的MS-20处理人类PBMCs达2天。以MTT分析测定细胞存活率。结果显示细胞存活率以 MS-20剂量依赖的方式增加。这些结果来自于2次独立实验的平均值。
[0016] 图5中显示海拉人类子宫颈癌细胞的存活率。以不同浓度的（a)MS_20或（b)L-lMT 处理海拉人类子宫颈癌细胞达2天。结果显示细胞存活率随着MS-20的浓度增加而降低。 这些结果以平均土标准偏差表示（η= 3独立实验）。
[0017] 图6显示MS-20以剂量依赖方式抑制ID0酵素活性。数据以抑制百分比（％ )表 示。这些结果以平均土标准偏差表示（η= 2独立实验）。
【具体实施方式】
[0018] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技 术人员一般所了解相同的含义。如此处所使用者，以下用语具有归因于该等用语的意义，除 非另有限定。
[0019] 在本文中，冠词"一"是指一个或一个以上（亦即，至少一个）该冠词语法上之受 词。举例而言，一组件是指一个组件或多于一个的组件。
[0020] 在本发明中，非可预期的发现，发酵大豆萃取物有效于抑制吲哚胺2,3双加氧酶 的活性，因而可作为ID0抑制剂。
[0021] 因此，本发明提供一种抑制吲哚胺2, 3双加氧酶（ID0)的方法，包括将发酵大豆萃 取物以有效于抑制ID0活性的含量投用于有需要的个体。
[0022] 本发明也提供发酵大豆萃取物用于制备抑制吲哚胺2, 3双加氧酶活性的组合物 的应用。本发明还提供一种抑制吲哚胺2, 3双加氧酶活性的方法，包括使吲哚胺2, 3双加 氧酶与有效于抑制ID0活性的含量的发酵大豆萃取物接触。
[0023] 根据本发明，此处所使用的发酵大豆萃取物是指通过利用至少一种乳酸菌和可视 需要的至少一种酵母菌使水溶性大豆萃取物发酵制得的萃取物。在一个实施例中，该至少 一种乳酸菌是乳杆菌属且该至少一种酵母菌是酵母菌属。在特定实施例中，发酵是使用 不同种类的乳杆菌属培养物（例如5、10、15、20、25或30种乳杆菌属菌株的培养物）来 实施，且较佳地，将至少一种酵母菌添加到不同种类的乳杆菌属培养物中。可用于发酵的 乳杆菌属菌株包括，但不限于，嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus)CCRC(食品工 业发展研究所生物资源保存及研究中心，台湾）10695、14026、14064、14065及/或14079; 德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillusdelbrueckiibulgaricus)CCRC10696、14007、 14009、14010、14069、14071、14098 及 / 或 16054 ;德氏乳杆菌乳亚种（Lactobacillus Iactislactis)CCRC10791、12267、12306、12312、12315、12323、14016、14015 及 / 或 14117;高加索酸奶乳杆菌（Lactobacilluskefir)CCRC14011及/或马乳酒样乳杆菌 (Lactobacilluskefiranofaciens)CCRC16059。可用于发酵的酵母菌菌株包括，但不限于， 酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae)CCRC20577、20578、20581、21494、21550、21797、 21805、22138、22234、22337、22731 及 / 或 22728 及 / 或乳酒假丝酵母菌（Candidakefyr) CCRC21269、21742及/或22057。具体而言，在发酵后进行一个或一个以上步骤，例如灭菌、 过滤、浓缩、冻干或其任何组合。较佳地，在发酵后通过例如加热进行灭菌，且可视需要地进 行过滤和浓缩。更佳地，可经由例如冻干来干燥发酵大豆萃取物，以获得呈粉末形式的发酵 大豆萃取物。在某一实施例中，本发明的发酵大豆萃取物是通过包含以下步骤的制程来制 得：(a)利用至少一种乳酸菌伴随至少一种酵母菌使水溶性大豆萃取物发酵，以形成发酵 液；(b)对该发酵液进行灭菌；（c)过滤经灭菌发酵液；和（d)自经过滤发酵液移除水，以形 成浓缩的发酵大豆萃取物。本文所用的发酵大豆萃取物可如美国专利第6, 855, 350号和第 6, 733, 801号来制备，所述专利的每一者都以全文引用方式并入本文中。
[0024] 如美国专利第6, 733, 801号所述，制备方法是将大豆属有机物（去脂后）与蒸馏 水按照1:10的比例混合。将混合物加热到100°c，并保持30分钟，然后过滤得到大豆属 萃取物。将牛肉和海藻在蒸馏水中保持沸腾状态30分钟，以得到肉汤培养基。加入盐、糖 和琼脂以得到特殊的琼脂培养基。向特制的琼脂培养基中加入乳酸菌和酵母菌株。培养基 中的乳酸菌和可选的酵母菌转移到大豆属萃取物中，在36-43Γ培养45-50小时。由于不同 种类的微生物根据其相似的生长特性而成群生长，因此最好在培养前将这些微生物群分开 加入到大豆属萃取