孔2X105的密 度接种于含有RPMI培养基的96孔培养板，RPMI含有10%胎牛血清，100单位/毫升青霉 素和链霉素（GIBC0)。将100ng/mL的人类IFNy(R&DSystems)及MS-20连续稀释液添加 至合适的孔，使得每孔最终体积为200yL培养基。在含5%C0 2的湿润培养箱中，于37°C 培育40-44小时后，收集来自三重复的孔的上清液并予以保存，以供藉由HPLC的色氨酸和 犬尿氨酸分析。对于剩余的细胞，进行MTT细胞存活分析，以测定经过各种处理后的细胞存 活率。
[0054] 1. 4在以海拉细胞为基础的ID0/犬尿氨酸分析测定抑制剂活性
[0055] 海拉细胞（#CCL_2)是从美国典型组织培养物中心（ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州） 获得，并常规维持于DulbecCO氏改良Eagle培养基（DMEM)，其含有10%牛胎儿血清，含有 100单位/毫升的青霉素和链霉素（GIBC0)。将细胞保持在37°C，供给5%C0 2的湿润培 养箱中。该分析如下进行：将海拉细胞以5X103每孔的密度接种在96孔培养板，生长过 夜。隔日，将50ng/mL的人类IFNγ(R&DSystems)及MS-20或L-1MT的连续稀释液，以每 孔200μL培养基总体积，加入到细胞中。经过额外40-44小时培养后，收集来自三重复的 孔的上清液并予以保存，以供藉由HPLC的色氨酸和犬尿氨酸分析。对于剩余的细胞，进行 ΜΤΤ细胞存活分析，以测定细胞存活率。
[0056] 1. 5藉由HPLC分析培养基中的色氨酸及犬尿氨酸。
[0057] 为了测定ID0活性，使用高效能液相层析法（High performance liquid chromatography)在反相测量上清液的色氨酸和犬尿氨酸的浓度，以及计算Kyn/Tryp [5]。
[0058]2.结果
[0059] 在以细胞为基础的ID0分析中，以IFNy刺激PBMC，观察到色氨酸的降解有提 升。相较于未经处理的细胞，IFNy刺激的PBMC的上清液含有显著较低的色氨酸的浓度 (P〈0. 001，表1及图1)。相较之下，在IFNγ刺激的细胞中，犬尿酸浓度显著上升（P〈0. 001， 未显示）。因此，Kyn/Tryp比例在IFNγ刺激的PBMC比在未经IFNγ刺激的PBMC还要高 (Ρ〈0· 001，表la及图1)。
[0060] 以0. 5-4mg/mL(0. 125% -1 % )的MS-20处理细胞，不影响静息细胞的色氨酸代 谢（数据未显示）。相较之下，在PBMC，以IFNy刺激提升了色氨酸的降解、犬尿酸的产生， 以及Kyn/Tryp比例以剂量依赖方式受到MS-20的影响（图2)。在IFNy活化的海拉人类 子宫颈癌细胞，也观察到类似受MS-20抑制的现象（图3)。的确，在海拉细胞受50ng/mL 的IFNγ刺激40-42小时后，在培养基中的色氨酸浓度下降到甚至低于检测限制（表lb)。 L-1MT，一种ID0抑制剂，平行地予以测试，以比较ID0抑制活性。以MS-20抑制ID0也可藉 由ID0酵素分析获得确认，结果类似于以细胞为基础的分析（图6;IC50 = 1. 86mg/mL)。 这些结果显示，MS-20有效地抑制ID0活性。
[0061]MTT(细胞存活率）分析结果显示PBMC的存活率在MS-20存在下增加（表la)，而 海拉细胞的存活率在MS-20最高浓度（4mg/mL)下，仅有轻度的降低（20%)。此等在PBMC 及海拉细胞的细胞存活率的改变是剂量依赖性的（图4-5)。综合判断之，由MS-20处理所 观察到的ID0活性降低并非因细胞数量或细胞存活率下降所致。
[0062] 表1 :在（la)初级人类PBMCs或（lb)海拉人类子宫颈癌细胞的上清液，在存在或 不存在MS-20或L-1MT(IDO抑制剂）的情形，未经刺激的或以IFNy刺激的色氨酸及犬尿 酸浓度及kyn/Tryp比例。
[0063]
[0065] 咸信本发明所属领域的技术人员基于本文的叙述，无须进一步之例示即可将本发 明应用至其最广泛之范围。因此，应了解此处所提供之叙述及权利要求书是供例示目的而 非以任何方式限制本发明之范畴。
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【主权项】
1. 一种发酵大豆萃取物用于制备抑制吲哚胺2,3双加氧酶活性的组合物的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其中所述的组合物有效于降低周边血单核细胞的吲哚胺 2, 3双加氧酶活性。3. 如权利要求1所述的应用，其中所述的组合物有效于增加周边血单核细胞的存活 率。4. 如权利要求1所述的应用，其中所述的组合物有效于提升免疫反应。5. 如权利要求4所述的应用，其中所述的免疫反应是T细胞调节的免疫反应。6. 如权利要求1所述的应用，其中所述的组合物有效于治疗吲哚胺2,3双加氧酶调节 的免疫低下。7. 如权利要求1所述的应用，其中所述的组合物包含另一吲哚胺2, 3双加氧酶抑制剂。8. 如权利要求1所述的应用，其中所述的另一吲哚胺2, 3双加氧酶抑制剂是1-甲基色 氨酸。9. 如权利要求1至8中任一项所述的应用，其中所述的发酵大豆萃取物是通过以至少 一种乳酸菌和可视需要的至少一种酵母菌使水溶性大豆萃取物发酵来制得。10. 如权利要求9所述的应用，其中该至少一种乳酸菌是乳杆菌属（Lactobacillus species)且该酵母菌是酵母菌属（Saccharomycesspecies)。11. 如权利要求9所述的应用，其中在发酵后进行一或多个选自由以下组成的群组的 步骤：灭菌、过滤、浓缩、冻干及其任何组合。12. 如权利要求9所述的应用，其中该发酵大豆萃取物是通过包含以下步骤的过程来 制得：a)以至少一种乳酸菌伴随至少一种酵母菌使水溶性大豆萃取物发酵，以形成发酵 液；b)对该发酵液进行灭菌；c)过滤经灭菌发酵液；和d)从经过滤发酵液移除水，以形成 浓缩的发酵大豆萃取物。13. -种抑制吲哚胺2, 3双加氧酶活性的方法，包括使吲哚胺2, 3双加氧酶与发酵大豆 萃取物接触，其中该发酵大豆萃取物的量有效于抑制吲哚胺2, 3双加氧酶的活性。
【专利摘要】本发明公开了发酵大豆萃取物作为吲哚胺2，3双加氧酶抑制剂的应用。具体地，本发明关于发酵大豆萃取物作为吲哚胺2，3双加氧酶(indoleamine？2,3-dioxygenase,IDO)抑制剂的应用。
【IPC分类】A61K36/48, A61P37/04, A61P37/02
【公开号】CN105311089
【申请号】CN201510321283
【发明人】路孔明, 林卫理, 陈旦生, 林育蔚, 郭任伟, 许郁婷
【申请人】中天生物科技股份有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年6月12日