以顶芽为启动材料的牛角瓜种苗组培快速扩繁的方法
【专利摘要】以顶芽为启动材料的牛角瓜种苗组培快速扩繁的方法，涉及植物无性繁殖的方法。本发明培养步骤包括：顶芽伸长；促腋芽快速增殖，即将增殖苗25天继代转接，重复此过程实现快速增殖；组培生根移栽等。本发明增殖系数和遗传性状稳定，且省去了壮苗培养阶段，以及生根后的自然光炼苗阶段，操作简单，生产成本低，能够满足牛角瓜优良单株的产业化生产需求。
【专利说明】以顶芽为启动材料的牛角瓜种苗组培快速扩繁的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物无性繁殖的方法，尤其是苗木生产的植物组织培养方法。
【背景技术】
[0002]牛角瓜ijOalotiropis gigantean)系萝蘑科牛角瓜属多年生直立灌木,高可达3m,又名断肠草、羊浸树、五狗卧花心，叶倒卵状长圆形或椭圆状长圆形，聚伞花序伞形状，腋生或顶生。牛角瓜主要分布在我国的云南、四川、广西和广东等省区，耐贫瘠、耐干旱，能够适应干热河谷、盐碱地、沿海沙滩等热带和亚热带地区的生态脆弱环境，如在云南干热河谷地区瘠薄的石砾土中均能正常生长，并开花结果，是困难地段植被重建时的重要先锋树种。
[0003]牛角瓜果实中的纤维，经处理后可得到具有一定柔软度的纤维，可替代棉纤维而用于纺织生产，织成的面料既有丝绸的滑爽质感，又有类似棉织物的舒适感和透气性，是一种新型的天然、环保、卫生的纤维原料，其纺织技术已十分成熟，在纺织领域具有很好的应用前景。而牛角瓜茎纤维的纤维素含量比棉低，与棉相比，牛角瓜茎纤维木质素含量很高，是一种适合生产更高强度、更耐用的复合材料的原材料。此外，由于牛角瓜果实有毒，可杀虫和驱蚊；其根、茎、叶、花、果及各部位的乳白色汁液均可药用，具有抗菌、解毒、消炎等功效，可用于治疗肿瘤、哮喘、溃疡等疾病；还可提炼树胶原料、黄色染料，做绿肥等，是一种多用途的经济植物。
[0004]目前，牛角瓜已经有规模化人工种植，其种苗繁殖方式常采用种子进行有性繁殖，也可通过扦插进行繁殖。由于在产业化发展过程中，为了提高其适应性和单位面积纤维产量，只有选用优良单株或优良种源作为母本材料进行扩繁，而将优良单株作为母株进行无性扩繁，是最为有效的方式之一，从而使母本的优良性状得以遗传。采用常规的扦插无性繁殖，需建立专门的采穗圃来提供插穗，而采用组培的方法进行繁育，只需少量材料就能够快速高效地实现优良单株扩繁。李克烈以牛角瓜的叶片为材料进行了组培育苗，通过诱导出愈伤组织，再从愈伤组织进行诱导分化芽，最后移栽成苗，移栽成活率为85% (李克烈，罗联忠，陈伟，等.牛角瓜的组织培养[J].广西农业生物科学，2007，26 (3): 247-249)。但通过叶片诱导愈伤组织再分化出苗的方法，容易产生变异苗。这是因为叶片由栅栏组织、海绵组织、表皮组织等构成，其诱导的愈伤组织会存在异质性；此外，植物组培过程中，经过愈伤组织途径或多次继代培养后，易导致分裂素不正常，也增加变异植株发生频率。
【发明内容】
[0005]针对目前牛角瓜育苗成苗方式存在的不足，本发明的目的在于以牛角瓜优良单株的顶芽为启动材料，通过促腋芽发生型方式，进行快速扩繁，从而提供一种遗传性状稳定，繁殖系数高，生根快，根系发达，移栽易成活的牛角瓜种苗组培快繁方法。
[0006]上述目的按以下的方法实现:
(2)顶芽伸长培养:将采集的顶芽进行消毒处理，去除叶柄、切除顶芽基部和顶端的褐化部分，控制顶芽长度在2-3cm之间，切除顶端褐化部分时需保留芽尖，两端褐化部分切除后，接种于顶芽启动培养基上，在启动培养条件下培养I周，顶芽开始生长，20天后将伸长生长的顶芽进行下一步的增殖培养；
所述的启动培养基为MS+6-BA0.1-0.3mg/L+NAA0.lmg/L+0.lg/L活性碳+30g/L白沙糖，pH 值 5.8-6.0 ；
所述的启动培养条件的光强为1500-2000LX，光照时间为12小时/天，温度为23±2°C ；
(3)促腋芽快速增殖培养:将伸长生长的顶芽去顶后切成带1-2个节间的茎段，去除茎段上的叶柄，横放在增殖培养基上进行培养，25天后进行继代转接，此后，重复本步骤，快速增殖，芽苗增殖后进行生根培养；
所述的增殖培养基为 MS+6-BA0.5-1.0mg/L+KT0.2 mg/L +NAA0.lmg/L+30g/L 白沙糖，pH值5.8-6.0 ;所述的培养条件与步骤(2)相同；
(4)丛生芽生根培养:将小苗单株切下，保留2-4个叶片，置于生根培养基进行培养，20天后生根培养生根率达100%，根系呈辐射状，单株平均根系10条以上；
所述的生根培养基为1/2MS+IBA0.1-0.3mg/L+0.lg/L活性碳+15g/L白沙糖，pH值5.8-6.0，所述的培养条件与步骤(2)相同；
(5)组培苗移栽和定植。
[0007]进一步，所述的方法是步骤(I)中所选取的牛角瓜优良单株上生长健状、尚未木质化的枝条为嫩枝。
[0008]进一步，所述的方法是步骤(3)所述的增殖培养的繁殖倍数为5倍以上。
[0009]进一步，所述的方法是步骤(4)所述的生根培养生根率20天后达100%，根系呈辐射状，单株平均根系10条以上。
[0010]进一步，所述的方法是步骤(5)所述的移栽和定植的组培苗根系长为2-4厘米，清洗粘附在根系上的培养基，移栽到消过毒的基质中，I个月后平均成活率达93%以上，3个月后用于造林；
所述的移栽基质为红心土:腐殖土:珍珠岩(体积比)=2:2:1。
[0011]本发明的技术进步和有益效果是:
本发明以顶芽为启动材料，顶芽生长活跃，伸长生长快，能够快速获得增殖所需的茎段。该阶段消毒时，将顶芽长度控制在3-4cm，消毒后接种长度控制在2-3cm，这样的长度范围可降低消毒的难度，减少平均污染率，有利于顶芽快速启动，并能在接种后提高顶芽存活率。
[0012]在增殖阶段，通过促腋芽发生型的增殖方式，将伸长的顶芽切成带1-2个节间的茎段，结合适中的激素浓度，使节间位置萌发多个小芽，并伸长生长，使材料快速增殖。
[0013]增殖培养配方的激素高于前述浓度，增殖苗细弱并偶有玻璃化现象，使得生根率下降，且生根所需时间延长；低于前述浓度或将分裂素KT更换为TDZ，增殖倍数仅有2倍左右，导致组培苗生产成本增加，作为反例，我们引用了培养基为MS+6-BA0.5mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.3mg/L+30g/L白沙糖的增殖情况，如图7所示，该配方的培殖倍数低，25天时增殖系数仅为2左右；培养基为MS+6-BA0.5mg/L+TDZ0.2 mg/L +NAA0.lmg/L+30g/L白沙糖的增殖情况，如图8所示，该配方的培殖倍数低，且在增殖时伴有根系的产生，不利于继代增殖。
[0014]在生根阶段，激素浓度过低则生根苗的生根数和生根率会下降，过高生根率会直接受到抑制，平均生根率只能保持在80%左右，且生根苗的根系及质量均一般，通过筛选出的培养基配方能够诱导发达的根系，苗木质量好，不需要自然光炼苗，即可进行直接移栽。
[0015]此外，移栽基质的选择与配比中，红心土能增加基质的粘性和保水性，腐殖土提供小苗营养，珍珠岩保证基质透气。如红心土过多，则会使基质不透气，导到积水，造成根系腐烂；如腐殖土配比过高，则导致保水性差，需增加浇水次数，且造林过程中苗木易脱水；如珍珠岩比例过高，保水保肥性均差，不利于根系舒展及小苗的高生长。因此，适当比例配合的红心土、腐殖土、珍珠岩能使基质保水、营养、透气协调较好，既有利于苗木成活，又保证了苗木根系的发育所需要的营养，以及减少造林过程中根系水分的散失，降低移栽过程中组培苗的死亡率。
本发明无愈伤组织的产生，避免了变异苗的出现，且方法简单，省去了壮苗培养阶段，以及生根后的自然光炼苗阶段，降低了生产成本。
[0016]故此，本发明生产的种苗遗传性状稳定，增殖快速，根系发达，抗逆性强，能够实现优良单株的工厂化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为顶芽接种1周后生长情况。
[0018]图2为顶芽培养20天生长情况。
[0019]图3为增殖培养阶段刚接种到增殖培养基上的茎段。
[0020]图4为增殖培养阶段增殖20天时的茎段增殖情况。
[0021]图5为生根及移栽的组培苗生根。
[0022]图6为生根及移栽的组培苗移栽。
[0023]图7 为培养基为 MS+6-BA0.5mg/L+KT0.2mg/L +ΝΑΑ0.3mg/L+30g/L 白沙糖的增殖情况。
[0024]图8 为培养基为 MS+6-BA0.2mg/L+TDZ0.2 mg/L +ΝΑΑ0.lmg/L+30g/L 白沙糖的增殖情况。
[0025]以下结合【具体实施方式】对本
【发明内容】
做进一步说明，实施例包括但不限制本发明的保护范围。
【具体实施方式】
[0026]实施例1:
(1)采集顶芽:于2013年7月中旬在云南省元江县牛角瓜基地，采集牛角瓜的优良单株上的生长健状、尚未木质化的枝条，该枝条优选生长健状、尚未木质化的嫩枝，去除叶片，当天带回西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室。
[0027](2)顶芽伸长培养:将顶芽用自来水冲洗5分钟，之后剪成4cm长的顶芽，用蒸馏水冲洗1次，用75%的酒精进行表面喷酒消毒处理，再将顶芽转移到超净工作台内，用0.15%的升汞消毒9分钟，消毒完毕后用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干水分，去除叶柄、切除顶芽基部和顶端的褐化部分，控制顶芽长度在2-3cm之间，在顶芽基部和顶端重新切口，顶端切口时注意保留芽尖。切好后，接种于顶芽启动培养基上，启动培养基为MS+6-BA0.lmg/L+NAA0.lmg/L+0.lg/L活性碳+30g/L白沙糖，pH值5.8-6.0。在启动培养条件下培养1周，顶芽开始生长，20天后将伸长生长的顶芽进行下一步的增殖培养。
上述启动培养条件的光强为1500-2000LX，光照时间为12小时/天，温度为23±2°C。
[0028](3)促腋芽快速增殖培养:将伸长生长的顶芽去顶后切成带1-2个节间的茎段，去除茎段上的叶柄，横放在增殖培养基上进行培养，增殖培养基为MS+6-BA0.5mg/L+KT0.2mg/L +NAA0.lmg/L+30g/L白沙糖，pH值5.8-6.0。10天后，茎段的节间处开始萌发小芽，25天左右即可转接相同增殖培养基上继代增殖，平均增殖倍数达5.3。之后重复本步骤，换言之，将增殖苗去顶后，同样切成带1-2个节间的茎段，转接到增殖培养基上，25天重复此增殖过程，芽苗增殖后进行生根培养。快速增殖，芽苗增殖后进行生根培养。所述的培养条件与步骤(2)相同。
[0029](4)丛生芽生根培养:将增殖获得的丛生芽进行生根培养，将小苗单株切下，保留2-4个叶片，置于生根培养基进行培养，生根用的培养基为1/2MS+IBA0.2mg/L+0.lg/L活性碳+15g/L白沙糖，pH值5.8-6.0。生根培养生根率20天后达100%，根系呈辐射状，单株平均根系15条，平均根长3厘米，进入下一步骤。所述的培养条件与步骤(2)相同。
[0030](5)组培苗移栽和定植。
[0031]实施例2:
除步骤(3)平均有效繁殖倍数5.3倍之后进行三次转接，待数量达到300瓶后，进行生根培养外，其余步骤与实施例1相同。
[0032]实施例3:
在实施例1中步骤(5)是:待移栽和定植的组培苗根系长3厘米时，清洗粘附在根系上的培养基，按体积比将红心土:腐殖土:珍珠岩=2:2:1混合，用多菌灵水溶液提前3天消好毒，营养袋规格为7cmX8cm，用塑料拱棚保湿，湿度控制在80%，温度控制在20_30°C，15天后开始少量掀开塑料膜，并减少浇水次数，空气湿度适当降低在70%左右，I个月后平均成活率达95%，期间注意除草，粗放管理，增强组培苗的抗逆性，3个月后达到造林要求。
【权利要求】
1.以顶芽为启动材料的牛角瓜种苗组培快速扩繁的方法，按以下步骤进行: (1)采集顶芽:选取牛角瓜优良单株上生长健状、尚未木质化的枝条，去除叶片，从顶芽下部3-4cm处剪断，保留顶芽部分3-4cm长，获得的顶芽进行下一步的消毒及培养； (2)顶芽伸长培养:将采集的顶芽进行消毒处理，去除叶柄、切除顶芽基部和顶端的褐化部分，控制顶芽长度在2-3cm之间，切除顶端褐化部分时需保留芽尖，两端褐化部分切除后，接种于顶芽启动培养基上，在启动培养条件下培养I周，顶芽开始生长，20天后将伸长生长的顶芽进行下一步的增殖培养； 所述的启动培养基为MS+6-BA0.1-0.3mg/L+NAA0.lmg/L+0.lg/L活性碳+30g/L白沙糖，pH 值 5.8-6.0 ； 所述的启动培养条件的光强为1500-2000LX，光照时间为12小时/天，温度为23±2°C ； (3)促腋芽快速增殖培养:将伸长生长的顶芽去顶后切成带1-2个节间的茎段，去除茎段上的叶柄，横放在增殖培养基上进行培养，25天后进行继代转接，此后，重复本步骤，快速增殖，芽苗增殖后进行生根培养； 所述的增殖培养基为 MS+6-BA0.5-1.0mg/L+KT0.2 mg/L +NAA0.lmg/L+30g/L 白沙糖，pH值5.8-6.0 ;所述的培养条件与步骤(2)相同； (4)丛生芽生根培养:将小苗单株切下，保留2-4个叶片，置于生根培养基进行培养，20天后生根培养生根率达100%，根系呈辐射状，单株平均根系10条以上； 所述的生根培养基为1/2MS+IBA0.1-0.3mg/L+0.lg/L活性碳+15g/L白沙糖，pH值5.8-6.0，所述的培养条件与步骤(2)相同； (5)组培苗移栽和定植。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(I)中所选取的牛角瓜优良单株上生长健状、尚未木质化的枝条为嫩枝。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是步骤(3)所述的增殖培养的繁殖倍数为5倍以上。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是步骤(5)所述的移栽和定植的组培苗根系长为2-4厘米，清洗粘附在根系上的培养基，移栽到消过毒的基质中，I个月后平均成活率达93%以上，3个月后用于造林； 所述的移栽基质为红心土:腐殖土:珍珠岩(体积比)=2:2:1。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征是步骤(5)所述的移栽和定植的组培苗根系长为2-4厘米，清洗粘附在根系上的培养基，移栽到消过毒的基质中，I个月后平均成活率达93%以上，3个月后用于造林； 所述的移栽基质为红心土:腐殖土:珍珠岩(体积比)=2:2:1。
【文档编号】A01H4/00GK104221866SQ201410531922
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月11日 优先权日:2014年10月11日
【发明者】唐军荣, 刘惠民, 马焕成, 罗明灿, 郑元, 伍建榕, 王连春 申请人:西南林业大学