专利名称：一种利用转基因技术获得高烷烃含量牛角瓜的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用转基因技术获得高烷烃含量牛角瓜的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
牛角瓜(Calotropis gigantea)属于萝蘑科,直立灌木,可高达3米,全株有乳汁， 幼枝被灰白色绒毛。零星分布于我国广东、广西、云南、海南等地。其乳汁可提炼树胶原料， 还可制鞣料及黄色染料。茎皮纤维坚韧，可制人造棉、造纸、制绳索、织麻布和麻袋等。种毛可作丝绒原料及填充物。牛角瓜为传统药用植物，在其分布的热带和亚热带地区有悠久的药用历史。到19 世纪80年代科学家在牛角瓜中发现含有烃类成分，由此牛角瓜作为能源植物逐渐得到重视。在早期对能源植物的筛查过程中发现牛角瓜可以生产生物原油，其主要成分为碳氢化合物。如果在10000株每公顷的种植密度下，其产量可以达到6. 6桶/公顷。这些生物原油经过分析已经证明是和石油主要成分相同的碳氢化合物，而且，这些物质的成分及含量并不随季节和土壤条件不同而产生明显变化。但是牛角瓜中烃类成分含量较低，无法满足工业利用的要求，因此提高牛角瓜中烷烃含量成为迫切需求。分子育种由于具有周期短、目标明确等特点，适用于高烷烃含量牛角瓜品种的培育。目前，生物合成烷烃的代谢途径的阐明主要来自对蜡质合成的研究结果。蜡质合成的代谢途径主要包括两个不同的代谢途径乙酰还原途径和脱羰基途径(Kunst L et al. Progress in Lipid Research, 2003,42, 51-80),其中烧烃就是脱羰基途径的一个重要的中间代谢产物。经过研究已经发现一些烷烃合成的关键酶，这些酶负责脂肪酸到烷烃的转化，具体的代谢途径为脂肪酸在酰基CoA还原酶的作用下生成脂肪醛，再进一步由脂肪醛脱羰基酶催化形成烷烃。Aarts 等(Aarts et al. The Plant Cell 1995，7，2115-2127)克隆了拟南芥的CERl基因，CERl主要在茎、花和果实中表达，在叶中表达水平较低。CERl蛋白与膜内在蛋白有相似性，是高度疏水性分子。因为CERl突变体中醛大量积累，而烃的含量却降低，所以推测CERl蛋白为脱羧酶，催化长链醛到烃的转化。Chen等(Chen X et al. The Plant Cell，2003，15，1170-1185)从拟南芥中克隆并鉴定了第一个能同时影响上表皮蜡质层和角质膜层组成和结构的基因WAX2，WAX2突变体与野生型相比具有以下变异角质层较野生型轻20%但厚36% ;蜡质组分总量降低78%以上；叶面水分蒸发显著增强；对除草剂的耐受力降低。通过对WAX2基因突变体的研究发现WAX2基因的突变封闭了醛类物质及其代谢物的合成，因此WAX2可能通过影响长链乙酰CoA的还原发挥作用，另外，WAX2突变体的表皮膜的瓦解现象说明WAX2可能在角质合成过程也是必须的基因。Kurata等(Kurata T et al. The Plant Journal，2003，36，55-66)随后也报道了 WAX2基因(另命名为 Y0RE-Y0RE)的克隆与基因表达部位的研究，WAX2 (Y0RE-Y0RE)只在茎表皮分生组织和嫩叶、茎、果实和根的形成初期的细胞中有特定表达，在生长的表面毛上有高表达，WAX2 (Y0RE-Y0RE)可能控制从酰基CoA向醒类和角质层组分的转化。Sturaro等(Sturaro M et al. Plant physiology,2005，138,478-489)在玉米中克隆了 WAX2的同源基因命名为GL0SSY1，该基因与玉米表皮的发育及蜡质的积累有关。另外，Pierre 等(Broun P et al. PNAS，2004，101，4706-4711) 在拟南芥中克隆了 WINl基因，研究发现该基因为一个乙烯诱导的转录因子，一些蜡质合成过程中的关键基因例如CERl，KCSl和CER2等均受到该基因的控制，利用转基因技术使该基因在拟南芥中过量表达发现植物叶表皮蜡质的含量达到对照组的4. 5倍，并且烷烃占到其中的85 %高于对照组的65 %。本发明利用发根农杆菌的介导将烷烃合成过程中涉及的一些关键基因转入牛角瓜中，获得牛角瓜转基因毛状根，经过在芽诱导培养基和生根培养基中的培养，最终获得了转基因牛角瓜，检测结果表明，本发明中获得的转基因牛角瓜的烷烃含量得到了明显提高。 目前尚未见到有关利用转基因技术提高牛角瓜烷烃含量的报道。发明目的及内容为了解决野生牛角瓜植株中烷烃含量较低的问题，本发明提供了一种通过转基因技术提高牛角瓜中烷烃含量的方法。该方法通过发根农杆菌的介导将烷烃合成过程中涉及的一些关键基因转入牛角瓜中，获得牛角瓜转基因毛状根，经过在芽诱导培养基和生根培养基中的培养，最终获得了转基因牛角瓜。本发明主要包括以下步骤I.提取拟南芥总RNA并反转录产生cDNA，以cDNA为模板，利用表I中的三对引物分别扩增WAX2、CERl和WINl基因，并将PCR产物插入T载体，然后进行DNA序列分析；2.将测序正确的WAX2、CER1和WINl基因用BamH I和Sac I从T载体上切下，分别插入植物表达载体PCAMBIA-1301，构建含外源基因的植物表达载体(图I)。为了使外源基因能够顺利表达在该载体的多克隆位点的Xba I和Sal I之间插入了 35S CAMV启动子， Sac I和EcoR I间插入了 NOS终止子。3.采用冻融法将构建的含外源基因的植物表达载体导入发根农杆菌ATCC15834 中，涂布含卡那霉素50mg/L的YEB平板后，在28°C恒温培养箱，培养2天后，挑取单菌落， 用PCR方法进行检测，检测为阳性的克隆用于感染牛角瓜无菌苗的叶片；感染后的外植体在黑暗条件下共培养2天，然后转至含有300mg/L头孢霉素的MS培养基，25± 1°C，16h/8h 光/暗培养，每隔2周转接一次，共转接3-5次，感染后约3-4周后产生毛状根，待毛状根长至2-3cm，用PCR方法分别对烷烃合成基因进行检测。4.将检测为阳性的发根切下转至芽诱导培养基上进行筛选，待获得的芽长至
l-2cm高时，转入MS培养基，经过2-3周培养，转化植株生根并长成完整再生植株；5.提取转基因牛角瓜的基因组DNA，利用表I中的引物，以获得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，检测转基因植株中是否有外源基因的转入；6.提取转基因牛角瓜植株的总RNA并反转录产生cDNA，利用表I中的引物，以 cDNA为模板进行PCR扩增，检测外源基因是否在转基因植株中表达；7.对获得的转基因牛角瓜进行烷烃含量的分析，筛选烷烃含量高的转基因牛角瓜植株。表I烷烃合成过程关键基因的克隆引物
权利要求
1.一种利用转基因技术获得高烷烃含量牛角瓜的方法，其特征在于包括以下步骤(1)烷烃合成过程关键基因的克隆；提取拟南芥总RNA并反转录产生CDNA，以CDNA为模板，根据烷烃合成过程关键基因的序列设计引物，对其进行PCR扩增，将获得的目的片段插入T载体，然后进行DNA序列分析；(2)植物表达载体的构建；将测序正确的基因用BamH I和Sac I从T载体上切下，插入植物表达载体，构建成含外源基因的植物表达载体；(3)通过发根农杆菌的介导进行植物转化；采用冻融法将含外源基因的植物表达载体导入发根农杆菌，涂布在含卡那霉素50mg/L 的YEB平板上，在28°C恒温培养箱中培养2天后，挑取单菌落，用PCR方法进行检测，检测为阳性的克隆用于感染牛角瓜无菌苗的叶片；感染后的牛角瓜叶片在黑暗条件下共培养2 天，然后转至含有300mg/L头孢霉素的MS培养基，25 ± I °C，16h/8h光/暗培养，每隔2周转接一次，共转接3-5次，感染后约3-4周产生毛状根，待毛状根长至2-3cm，用PCR方法进行检测；(4)转基因植株再生；将检测为阳性的毛状根切下后转至芽诱导培养基上进行生芽培养，待获得的芽长至 l-2cm高时，将获得的再生芽转入生根培养基，经过2-3周培养，再生芽生根长成完整再生植株；(5)转基因植株的检测和筛选；对转基因植株采取三步法筛选，第一步，采用PCR方法扩增转基因植株的目的基因，检测外源基因是否转入；第二步，对PCR检测为阳性的转基因株系进行RT-PCR分析，判断外源基因是否在转基因植株中表达；第三步，对获得的阳性转基因植株进行烷烃含量的分析，筛选高产烷烃的转基因牛角瓜。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤I)所述的烷烃合成过程关键基因为 WAX2、CERl 和 WINl 中的一种。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的烷烃合成过程关键基因的克隆引物是根据Genbank中拟南芥WAX2、CER1和WINl的mRNA序列进行设计,其序列如表I所示。表I烷烃合成过程关键基因的克隆引物基因引物CERlcerR cerF 5 ’-CGGGATCCATGGCCACAAAACCAGGAGTCCT-3 ’ 5 ’-GCGAGCTCTCACAGGAGTGGACATCCACCAGA-3 ’WAX2waxR 5 ^cgggatccatggttgcttttttatcag-s ’ WaxF 5 ’-GCGAGCTCTCAATTTGTGAGTGAAGAAACA-3 ’WINlwinR: winF:5 ^cgggatccatggtacagacgaagaagttc-s ’ 5 ’-GCGAGCTCTTAGTTTGTATTGAGAAGC-3 ’
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤2)所述的植物表达载体为pCAMBIA-1301，该载体多克隆位点的Xba I和Sal I之间插入了 35S CAMV启动子，Sac I和 EcoR I间插入了 NOS终止子。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤3)所述的发根农杆菌为ATCC15834。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤3)所述的检测转基因发根所用的 PCR引物如表I所示。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征是步骤4)所述的芽诱导培养基是MS+0.Img/ L NAA+0. lmg/L 6-BA 或 MS+0. 5mg/L NAA+4. Omg/L 6-BA，生根培养基为 MS。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤5)所述的转基因植株PCR和RT-PCR 所用的引物如表I所示。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤5)所述的牛角瓜转基因植株中烷烃的提取及检测方法如下牛角瓜转基因植株在50°C下干燥至恒重，粉碎后过40目筛，按液固比20 I向粉碎的样品中加入正己烧，剧烈混合IOmin后，5000rpm离心IOmin进行液固分离,取上层液相到一新容器中；按上述方法重复提取两次，合并三次正己烷相，50°C减压蒸馏回收正己烷，膏状物即为烷烃物质粗提物；得到的烷烃提取物用正己烷溶解后用气相色谱进行检测；检测条件如下进样口 250°C，分流比40 I检测器350°C柱温升温速率。C /分温度。C保持时间(分)-50O. 5103505.0根据样品中各烷烃色谱峰的保留时间与C8-C4tl alkane window标准品中各烷烃的保留时间进行比较，确定牛角瓜转基因植株中烷烃种类；分别利用烷烃标准品建立牛角瓜转基因植株中含有的各种烷烃的标准曲线，并计算牛角瓜转基因植株中各种烷烃的含量；牛角瓜转基因植株中含有的各种烷烃的含量总和即为牛角瓜转基因植株的烷烃含量。
全文摘要
本发明提供一种利用转基因技术获得高烷烃含量牛角瓜的方法，属于生物技术领域。该方法通过将植物烷烃合成过程中涉及的一些关键基因构建到植物表达载体pCAMBIA1301中，得到的嵌合体DNA通过发根农杆菌的介导转化牛角瓜无菌苗的叶片，得到的毛状根经诱导分化后得到转基因牛角瓜植株。通过对获得的转基因植株进行PCR及RT-PCR分析，结合气相色谱对烷烃含量的检测，筛选出高烷烃含量的牛角瓜转基因植株，规模化繁育后进行人工种植。本发明获得的转基因牛角瓜植株烷烃含量较野生植株提高30％以上，且具有耐盐碱、耐干旱、耐瘠薄等特性，在生物能源等领域具有巨大应用潜力。
文档编号C12Q1/68GK102586271SQ20121000726
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者孙健, 王晓东, 赵兵 申请人:中国科学院过程工程研究所