用于保护皮肤的包含五水合铜盐和七水合锌盐的杀菌制剂的制作方法

本发明属于在哺乳动物中临床应用的皮肤病制剂领域。特别地，本发明提供了一种用于保护皮肤，预防或者治疗皮肤感染的广谱杀菌组合物或制剂，它结合了作为活性杀菌化合物的五水合铜盐和七水合锌盐以。在一个优选的实施方案中，所述制剂包括塑化剂和润肤剂以增强制剂对皮肤的附着作用。在本发明的另一个优选实施方案中，由于制剂在挤奶动物乳腺炎的预防和/或治疗中的应用，所述制剂在牛奶生产行业是有用的。
背景技术：
：牛乳腺炎是乳腺的炎性疾病，并且成为了全球挤奶行业所面临的主要经济和生产问题之一。与此疾病相关的高成本源于它在动物健康和福利方面的影响以及由于在牛奶的生产和质量上的影响而产生的在销售盈利能力方面的影响。年度亏损包括抗生素治疗、兽医护理、销毁和在牛奶生产方面的损失的费用。牛乳腺炎是一种起始于微生物通过乳头管孔入侵和定植的疾病，造成乳腺变得肿胀，导致牛奶的物理和化学性质改变。细菌是牛乳腺炎所涉及的主要微生物，尤其是其中的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和乳腺链球菌。乳房内感染造成两种牛乳腺炎：临床型和亚临床型。对于乳腺和/或牛奶的临床改变的临床表现特征表现为感官改变(凝块和黄色的形成)。在亚临床型乳腺炎中，视觉症状是没有的，但是牛奶样本呈现出高的体细胞计数。因此，根据Schukken，当体细胞计数高于200,000细胞每毫升时，确定为牛乳腺炎，降低了牛奶的商业价值。控制乳腺炎的经典技术包括不同的策略，诸如在母乳喂养期结束后治疗奶牛、挤奶技术、用外用抗菌物质给乳头消毒(预浸泡或浸泡)以及采用抗生素治疗临床型乳腺炎。众所周知，奶牛乳头皮肤永久暴露于环境污染；首先，这是由于对产奶奶牛的操作，即奶牛是在与受尿液和排泄物污染的牲口棚相同的牲口棚中放牧和睡眠。另一种形式的污染为实际的挤奶地点(挤奶房)；在这里，存在通过挤奶设备的高污染暴露，尤其是是与乳头皮肤直接接触的挤奶杯；在挤奶之前使用毛巾处理准备奶牛，即在放置挤奶机之前干燥乳头；以及挤奶工的手，所有这些因素都是动物间交叉污染的载体。因此，在完成挤奶过程之后有必要保护乳头，通过应用消毒产品持续大约5到6分钟。在现有技术中，存在许多消毒产品，尤其是为乳头和乳房定制的，并被称为“乳头药浸”。这些产品中的许多为基于碘的化合物，即它们使用溶液中有7000到10000ppm碘的碘消毒剂。尽管采用此种碘溶液作为消毒剂，奶牛仍旧被污染和感染，当由于通过挤奶杯提取牛奶造成的吮吸效果产生的乳头括约肌仍处于开放状态时，在挤奶之后，这样的事情发生。对于牛奶产业，牛乳腺炎仍旧是一个世界性的问题。在乳头管中形成的空间使得污染很常见，尤其是当所使用的消毒剂在有机物的存在下变得失活而丧失有效性时，如在碘化合物的情况下。因此，有必要提高所使用的消毒剂溶液的质量以便保护乳头免受感染，所述溶液应当具有强杀菌力以便消除存在于乳头皮肤的所有细菌和微生物，不被存在的有机物失活，并且以便在乳头皮肤上持续具有活性直到下次挤奶。应当通过依附于皮肤和通过活性化合物的活性给予有效性。不好的依附会造成产品脱离皮肤，在这种情况下，由于机械缺陷，丧失了产品的所有有效性。本发明是在寻求解决此特定技术问题的方案的背景下提出的。技术实现要素：如以上所指出的，市场上有许多应用到乳头的基于碘和氯己定的产品。但是，这些产品存在许多限制，这使得有必要寻找新的方案以解决此问题。例如，基于碘的产品尽管没有感染，但是它们刺激和干燥皮肤，并且它们的持续使用会造成乳头损伤和流血。另一方面，碘和氯己定两者在有机物存在时均会失活，并丧失它们的有效性。发明人已经对这个问题研究了很长一段时间，这引导他们开发了一种用于保护皮肤的基于铜盐的第一个杀菌产品。所述产品受申请CL1774-2012保护。此产品具有不因存在有机物而失活的优点，并且它不刺激皮肤，虽然它的杀菌力并不是非常高，并且存在一些对采用此产品治疗具有耐药性的疾病。在现有技术中，我们还可找到治疗皮肤问题的基于氧化铜和氧化锌的混合物，申请CL3434-2012描述了该化合物。在所述混合物中使用的氧化物并不是水溶性的，并且不能预期的是，用作粒子分散体，非水溶性化合物的特性可以预期获得有相同元素的水溶性盐的结果。对于应用在动物的乳头上，制剂必须为液体，以便乳头可以淹没在其中并且进而干燥形成覆盖膜。为了实现这个，化合物必须为水溶性的，这在CL3434-2012中所描述的制剂中是没有发生的，在CL3434-2012中所获得的产品是膏状的，而不是液体制剂。2004年3月25日的文件US2004058011(PETERSSONLENNARTG)涉及一种在挤奶间隔用于乳头治疗的制剂，所述制剂包括结合有非水溶性锌化合物的氯己定；参见第11段：“锌以下述材料形式存在：含锌的、粒子的、精细分割的以及选自由以下形式组成的组的形式，包括硬脂酸锌、氯化锌、硝酸锌、油酸锌、氧化锌、磷酸锌、过氧化锌、碘化锌、锌元素以及它们的组合”。附图说明图1.分离自牛奶样品的细菌种类的分布。鉴定自临床和亚临床型乳腺炎的分离菌53和43分别从中央区域显示。在南部区域，临床和亚临床型乳腺炎的分离菌174和93被分别鉴定。包括经常被分离出来的其它微生物部分≦2％。图2.用于分离自具有：A)牛亚临床型乳腺炎(N＝227)和B)临床型乳腺炎(N＝136)的牛奶样品的微生物的根据本发明的组合物的MIC值的频率。每个测定做了一式三份。图3.根据本发明的组合物对临床型牛乳腺炎中被鉴定的最高频率的分离菌的MIC值的频率。细分条块代表对于牛乳腺炎的不同分离菌的MIC值(从0.25至0.5mg/L)的频率的分布。具体实施方式本发明涉及一种杀菌制剂，所述杀菌制剂用于保护皮肤免受细菌感染，并且包括两种活性杀菌化合物(五水合铜盐和水合七锌盐)的组合。铜的抗菌效果是作为对预防乳腺炎的一个有利选择，在其它皮肤病中，通过联合使用锌进行强化。为了提升杀菌力和对有机物不会变得失活以及保持对皮肤无刺激，发明人研发本发明的组合物包括0.01％到10％的五水合铜盐和0.01％到10％的七水合锌盐。如本说明书的实施例3中所示，新组合物通过完全控制细菌感染并消除所有在乳房中存在的细菌实现了预料不到的技术效果，使得在牛奶产品中没有发现细菌。根据上述内容，显示出本发明没有在先前的现有技术中被预期。此外，毫无疑问本发明的优选应用是在挤奶动物的乳头上面以预防或者治疗皮肤感染。尽管如此，如实际上所示，本发明的制剂具有重要的杀菌特性；因此这在任何动物中，甚至是人类，预防或者治疗任何种类的皮肤感染都是有用的。由于活性化合物的杀菌特征，本发明的制剂对预防或者治疗任何种类的皮肤感染(无论是细菌、病毒还是真菌)都是有用的。发明人已发现这些水溶性铜和锌盐的组合物可以持久控制皮肤病原体感染。在优选的实施方案中，本发明的制剂作为用于挤奶动物的乳房、挤奶间的洗浴，在乳房感染的治疗和预防中是有效的。尽管有这种优选的实施方案，本发明的制剂还可以应用在任何类型的皮肤上来保护皮肤免受感染，如细菌、真菌或者病毒感染。可以应用本发明的制剂以预防或治疗任何皮肤感染。优选地，五水合铜盐对应于五水硫酸铜，以及七水合锌盐对应于七水硫酸锌。考虑到本发明化合物组合物的高杀菌特性，有可能以非常低的浓度的五水合铜盐和七水合锌盐两者化合物获得有效的杀菌制剂。优选地，本发明的制剂具有0.01％至2％的五水合铜盐和0.01％至2％的七水合锌盐。尽管有以上的内容，有可能获得两种盐的更加浓缩的制剂以便于制剂运输或者用于难治性感染的准时应用，其中这些浓缩制剂也在本发明的范围之内。浓缩的制剂能够含有2％至10％或更多的每一种化合物；因此，本发明的范围为0.01％至10％之间的五水合铜盐和0.01％至10％之间的七水合锌盐。在准备应用到皮肤的优选的本发明的制剂中，包括0.05％至1％的五水合铜盐和0.05％至1％的七水合锌盐。并且，在特别优选的实施方案中，容易应用到皮肤的本发明的制剂包括0.2％至0.4％的五水合铜盐和0.05％至3％的七水合锌盐。考虑到活性化合物的水溶性情况，本发明的制剂是水性的。这样，制剂溶剂优选为水，但是任何适于皮肤的亲水溶剂都可以被使用。而且，本发明的制剂包括制剂辅料，所述制剂辅料选自粘度调节剂、保湿剂、润肤剂、塑化剂和着色剂。这些辅料应选自在实现本发明时的现有状态中任何可以获得的那些辅料。尽管有以上内容，以下为优选的辅料。作为粘度调节剂或者稠化剂，优选黄原胶，占组合物的0.2％至2％。作为润肤剂和保湿剂，优选甘油、山梨醇、丙二醇、聚乙二醇、芦荟、羊毛脂和它们的混合物，其中润肤剂和保湿剂占化合物的5％至30％。尤其地，组合物含有占化合物5％-12％的甘油。此外，在优选的方式中，化合物包括占化合物3％至10％的山梨醇。如果制剂为用于在挤奶之间的乳房治疗的化合物，重要的是所述制剂应当含有化合物附着到乳头皮肤的塑化剂。聚乙烯醇特别优选作为塑化剂，并且它占化合物的3％至10％，优选化合物的5％至8％。着色剂的目的仅仅在于视觉识别化合物的应用。着色剂占化合物的0.01％至0.5％。任何适于皮肤的着色剂都是合适的；但是，在优选的实施方案中，可接受水平的着色剂优选为食品添加剂，诸如Allura着色剂。本发明的制剂对制备适于预防或者治疗皮肤感染的药物是有用的。感染的治疗或预防是通过在将要被保护的皮肤区域直接应用含有本发明制剂的药物，重复并间隔数小时或者数天实现的，这在皮肤将要被保护期间和/或直到感染消失。在一个实施方案中，本发明的制剂用于在挤奶之间覆盖被挤奶的动物的乳头皮肤。在对动物挤奶之后，乳头淹没在本发明的制剂中并且让其干燥，在乳头上形成保护膜。在这种情况下，制剂包括在皮肤上形成聚合物层的聚乙烯醇或者其它塑化剂，在皮肤上给予更好的保护盒杀菌活性组分的持久性。制剂的粘度同样重要，因为如果制剂太液体的，它会在形成聚合物层之前脱落，而不能适当地附着，因此，当制剂用于治疗挤奶动物的乳头时，采用黄原胶或者其它粘度调节剂稠化。当采用本发明的优选的实施方案时，在乳头皮肤上形成膜需要1至2分钟以便充分密封乳头皮肤。这种密封保持超过12小时，这为挤奶之间通常的时间段。在下一次挤奶之前，操作人员从乳头上清洗掉化合物，以便使得化合物不会进入牛奶中。这样，挤奶动物的乳房的乳腺炎被预防或者治疗。令人惊讶的是，已经发现本发明的制剂通常可治疗持续的乳房感染，诸如那些非常普遍和难以控制的由金黄色葡萄球菌、链球菌和诺卡氏菌引起的乳房感染。自然地，本发明的制剂在预防和治疗由任何其它现存的病原体(诸如无乳链球菌、牛链球菌、无乳链球菌性、链球菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、大肠杆菌或其它菌)引起的感染也是有用的。根据所做的敏感性测试，浓度低至0.5mg/L的根据本发明的组合物或者制剂能够抑制不同细菌种类的生长，包括那些分离自临床型和亚临床型乳房炎的细菌种类。在这种情况下，制剂显示出更高的频率，甚至对抗生素耐药性的菌株也是如此，例如新霉素、庆大霉素和头孢噻肟。以下是一些本发明优选的实施方案的示意性实施例。实施例实施例1：根据本发明的制剂制备为了制备一种本发明的制剂，操作在具有以1.5rpm永磁搅拌的食品级不锈钢反应器上，在50℃至60℃温度的热调节浴中进行。在这种情况下，在60℃操作。针对所获得的溶液或者制剂，所有浓度表示为重量体积百分比。处理是在两个阶段进行。在第一阶段中，如所指示的，以100升60℃软化水起始所述处理。缓慢加入0.35％的五水硫酸铜盐、0.15％的七水硫酸锌、0.03％的Allura着色剂和0.4％的黄原胶，确保没有团块形成。混合物以1.5rpm搅拌保持30分钟。在第二阶段，温度保持在60℃并以1.5rpm搅拌；首先将6％的聚乙烯醇缓慢加入到先前的混合物中，不要形成团块，然后加入8％的usp甘油，并最终加入5％的山梨醇。一旦所有制剂组分被混合，在2.5小时期间通过在相同温度和转速搅拌保持下使其均质化。这赋予了准备包装的制剂稳定性。在此实施例中获得的本发明的制剂组分总结在了如下表1中。表1：根据本发明的制剂组合物的实施例组分重量/体积％五水硫酸铜0.35％七水硫酸锌0.15％黄原胶0.4％Usp甘油8％山梨醇5％聚乙烯醇6％Allura着色剂0.03％Csp软化水100％实施例2：本发明的化合物组分间的协同作用为了证实本发明化合物的优点之一，在平板或抗菌谱上采用挤奶动物的乳房皮肤上最常见的细菌感染进行细菌生长抑制测试。对此，金黄色葡萄球菌、乳腺链球菌和诺卡氏菌的克隆分别采用PCA培养法即非选择性方法种植在琼脂平板上，以便让细菌在整个培养皿表面板上生长。每个细菌种植三块板。稍后，在每块板的中央，放置浸渍有将要分析的杀菌化合物的纸圈。然后，所有平板在37℃下孵育24小时。在每种情况下，测量抑制晕。结果显示在表2中。表2：对每个活性杀菌组分的抑制晕正如在结果中可以清楚地看出的，本发明的化合物清楚地显示出超出评估的替代化合物的优点，铜和锌的混合物要好于仅仅采用铜，并且更加好于目前最长使用的杀菌化合物碘。实施例3：实地测试将在实施例1中获得的本发明的制剂作为乳房保护剂在挤奶间隔应用到一组100只的奶牛，其中所述的一组100只的奶牛已经预先接受了两种不同的治疗。该兽群已经采用基于碘的商售化合物治疗了数年，该兽群应当被视为初始情况，因为尽管采用了基于基于碘的商售化合物治疗治疗，在牛奶中仍存在大量细菌并且乳房感染的程度高。稍后，该兽群采用本申请发明人的混合物进行治疗，所述混合物受申请CL1774-2012保护，仅含有五水硫酸铜作为活性化合物，其配方总结在表3中。表3：制剂组合物实施例组分重量/体积％五水硫酸铜0.5％羊毛脂2％黄原胶0.3％Usp甘油6％着色剂1％软化水90.2％在大约一个月的期间内，兽群采用表3中的化合物进行治疗，并且在牛奶罐里发现了一种重要病原体和体细胞减少。但是，发明人发现一些感染是难以治愈的，因为在一个月(31天)的每日应用之后他们仍旧持续存在。由于这种原因，研发了新的本发明的化合物，在25天期间内所述新的本发明的化合物被应用到同样的兽群，用于在挤奶间隔的乳房保护。在经过25天治疗之后，分析罐中的兽群牛奶，并且实际上不存在可检测的病原体。除此之外，发现奶牛的乳房是健康的。这些治疗结果显示在下表4中。表4：对每种类型的治疗的细菌学分析正如可以看到的，本发明的组合物消除了牛奶中的细菌感染和环境病原体，并且因此所述牛奶中的体细胞也显著地降低。有必要强调在0时刻(初始条件)，该兽群并不是没有接受过任何治疗的兽群，但是我们已经说明了商售的基于碘的化合物被应用以覆盖乳房，如分析中所示，乳房上的许多感染和病原体转移到了牛奶。首先，31天采用基于铜的化合物的治疗能够降低牛奶中总细菌到41.8％，虽然非常好，但是还不够，然而本发明的基于铜和锌的组合物将总细菌降低到了检测线以下。实施例4：细菌菌株的流行程度的测定分析来自智利两个地域的总共386份具有乳腺炎的牛的牛奶样品。根据样品的起源和牛乳腺炎的严重分级(亚临床型的或者临床型)，分离了总共363株具有不同流行程度的菌株。金黄色葡萄球菌(30％)在以草为基础的生产的南部最多。用碘作为密封剂先对被分析的动物进行了消毒。用于细菌菌群分离和鉴定的样品以3,000rpm离心5分钟，并在有氧或者无氧条件下播种到有选择性和富集作用的培养基的板上，所述培养基如5％的McConkey琼脂和羊血琼脂，以便支持大多数兼性厌氧、需氧和维需氧细菌的良好生长。孵育之后，在革兰氏染色后可疑的克隆在选择培养基上进行再培养。根据这些结果，对所述细菌进行生化分析，如API20CAUX(Biomerieux),API20E(Biomerieux),APICoryne(Biomerieux)andCrystalBundesliga(BBL)以确认初步微生物诊断。所有分离和鉴定的微生物储存在-80℃直到稍后使用。相比中央区域，来自南部区域具有临床型乳腺炎信号的牛奶样品占总数的27％，在中央区域临床型乳腺炎的样品达到所接收的样品的56％。根据微生物分析，出现了101(26％)个阴性培养物并且来自剩余样品的总共363个微生物被分离(表5)。鉴定了微生物的高度多样性，主要是在亚临床型乳腺炎的牛中(图1)。表5：牛奶样品和分离的微生物的数量在中部区域的动物中，亚临床型乳腺炎的样品检测以中枢神经系统和乳腺链球菌为最常见的情况，分别在15(28％)和9(17％)。在临床型乳腺炎的动物中，大肠杆菌(13,31％)被检出频率最高并且CNS被检出频率是第二最高。在此区域中无乳链球菌性仅在的临床型乳腺炎的样品中被鉴定。对于取自南部区域中的样品，金黄色葡萄球菌、CNS和乳腺链球菌为流行的细菌，在临床型和亚临床型乳腺炎中均是(图1)。当将两个地理区域中的分离自临床型乳腺炎的细菌微生物丛进行比较时，结果显示大肠杆菌仅在中央区域被确定，而金黄色葡萄球菌仅在南部区域被确定。乳腺链球菌的分离频率在南方区域相比于中央区域要大(分别为23％比5％)。此外，在亚临床型和临床型乳腺炎的样品中确定的棒状杆菌属的分离菌在两个区域具有类似的频率。在中央区域，大肠杆菌为流行细菌(在临床型乳腺炎中为31％)，这大概与该区域的牛约束系统相关。实施例5：本发明的组合物的最小抑菌浓度的测定在选择性培养基中孵育386个具有乳腺炎的牛的牛奶样品并通过生化分析鉴定菌群之后，通过采用琼脂糖稀释法测定最小抑菌浓度来评估所有分离菌对根据本发明的组合物的易感性。对抗生素的易感性也通过琼脂糖稀释法进行测定。最小抑菌浓度(MIC)应用标准微生物学方法(CLSI2012a)通过琼脂糖稀释法测定。这样，MuellerHinton(MH)琼脂板补充有从0.03mg/L至1mg/L不同浓度的根据本发明的组合物。一夜培养物稀释到1×106细胞/ml的浓度，且它们中的5μl采用微孔板复制器以斑点形式接种。每项试验执行三次。根据本发明的组合物的MIC被限定为制剂的最低浓度，在所述浓度37℃的条件下微生物孵育一夜之后没有出现生长。结果显示出大多数分离的微生物在浓度为0,13mg/L(146/363)和0,25mg/L(92/363)时被抑制。其余的微生物在根据本发明的组合物的浓度在更大的范围0,37mg/L-0,5mg/L之间时被抑制。细菌物种的行为显然与牛奶样品的起源没有关系：注意到在临床型和亚临床型乳腺炎分离菌间的MIC值的频率存在轻微的不同(图2)。总共77(57％)个具有临床型乳腺炎的分离菌显示根据本发明的组合物的MIC值在0.25至0.5mg/L之间。相反，只有47个(21％)亚临床型乳腺炎的分离菌需要所述范围的组合物浓度来被消除。在临床型乳腺炎的样品中鉴定的最高频率的分离菌的MIC值的频率分布显示在图3。分离自临床型乳腺炎的不同菌株的MIC值在0.37mg/L至0.5mg/L的范围内变化。其中11(39％)个金黄色葡萄球菌显示更高的MIC(0.5mg/L)。超过一半的CNS和乳腺链球菌分离菌采用0.12mg/L或更少的根据本发明制备的组合物来抑制。实施例6：抗菌药物敏感性测试评定以下抗菌药物(OxoidLtd.Hampshire,英国)：·阿莫西林/克拉维酸(AMC)，·Trimethropin/磺胺甲恶唑(SXT)，·头孢噻肟(CTX)，·庆大霉素(GN)以及·新霉素(NE)。依照由临床实验室标准研究所指南(CLSI2012b)和BSAC标准((AndrewsandTrial2008)提供的建议，根据Kirby-Bauer盘法分析细菌标本。在有氧环境中以35℃在MuellerHinton琼脂糖板中孵育微生物18-24小时。作为质量控制，采用了大肠杆菌(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(25923)。CLSI临界点用于解释所有微生物试剂的敏感性。为了确定新霉素(NE)的临界点值，应用了BSAC标准。抵抗抗生素的耐药模式显示245/363(67.5％)的分离菌同时对试验中的所有抗生素都敏感。在这些分离菌中，81/425(33％)为具有临床型乳腺炎的牛奶样品。亚临床型的乳腺炎的分离菌与具有临床型乳腺炎的人相比显示出更低的耐药性频率。在中央区域，注意到CTX,AMC,Tet和NE抗生素在临床型乳腺炎的分离菌中显示超过10％的耐药性频率。在南部区域，只有AMC和NE满足此条件。分离自临床型乳腺炎的具有最高的抗抗生素耐药性频率的菌株显示在表6中。分离自中央区域的大肠杆菌对测试的不同抗生素具有不同的耐药频率。特别地，7/13(54％)的分离菌对Ne耐药，分离自在南部区域中的具有临床型乳腺炎的牛奶样品的乳腺链球菌显示对氨基糖苷类GN和Ne高频率耐药性(43和52％)。一些乳腺链球菌的分离菌还对CTK耐药(24％)。分离自中央和南部区域的金黄色葡萄球菌和CNS显示出对几乎所有测试的抗生素的低耐药性。表6.具有较高频率的临床型牛乳腺炎的分离菌对抗菌药物的耐药性包括在本申请中的实施例为说明性特征，并且它们不限制如下权利要求所保护的本发明的范围。当前第1页1 2 3