本发明涉及植物组织培养技术，具体涉及一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法。
背景技术：
利用植物小孢子培养技术可以获得单倍体(Hapiods)或双单倍体(Doublehapiods)植株，这种植株是遗传研究及转基因研究的理想材料，在育种工作中具有极大的利用价值。而油菜小孢子胚状体诱导率低一直是限制该技术广泛应用的一个问题，虽然目前小孢子的诱导培养方法很多，其中以申请号为200810300457.9中国专利申请效果最好，但其需要在诱导过程中通过鉴定小孢子的膨大率对诱导材料进行了提前筛选，只有膨大率大于50％的材料才能产生胚，而膨大率小于50％的材料则很难活无法产生胚，因此从实质上将还是无法解决诱导率低的问题；因此，寻找一种诱导率高的甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法显得至关重要。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法，该方法不仅小孢子的诱导率高，且小孢子植株易于再生。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法，具体包括如下步骤：
步骤一、游离小孢子的制备：在大田中选取开花3-7天的甘蓝型油菜花序，选择3.0-4.0mm的花蕾，将其放入滤布中，在无菌条件下用70％酒精消毒1min，然后用0.1％升汞消毒10min，无菌水冲洗3-5次，经清洗和灭菌后的花蕾放入pH为5.8-6.0、含质量浓度13％的蔗糖的B5无激素液体培养基中，轻压挤出小孢子，经300目尼龙网膜过滤到离心管里，于800rpm离心8min，去掉上清液；再加入相同的B5无激素液体培养基在同样转速下离心5min，去掉上清液，即得游离甘蓝型油菜小孢子；
步骤二、小孢子胚状体的诱导：将制备好的甘蓝型油菜小孢子加入含质量浓度16％的蔗糖的NLN-13无激素液体培养基中，于30-35℃暗培养8h，然后向其中加入等体积的含质量浓度4％的蔗糖、含105mg/L秋水仙素的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，于30-35℃继续暗培养24h，然后用不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基清洗离心，除去秋水仙素，然后加入相同培养基即不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，25℃恒温静置暗培养5天，最后加入不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为13％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，调节小孢子的密度为1个花蕾/mL，在25℃恒温静置暗培养至胚状体产生；
步骤三、小孢子植株的培育：将产生胚状体的小孢子置于80rpm的摇床上、25℃条件下暗培养1-2周，然后将正常发育的小孢子胚转入含0.8％质量浓度的琼脂，3％质量浓度的蔗糖，0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤，0.02mg/L NAA且pH5.8-6.0的B5固体培养基中，置于22℃、16h光周期培养箱内培养，2-3周转换一次培养基直到植株生长成为正常不定芽苗，然后再转生根培养基和盆栽驯化，最后移栽大田。
进一步的，其特征在于，步骤三种所述的B5固体培养基中还含有0.5％质量浓度的活性炭。
进一步的，步骤一种所述花蕾为3.5mm。
与现有技术相比，本发明所取得的有益效果如下：
1、本发明在小孢子胚状体的诱导过程中，先采用含16％质量浓度的蔗糖的NLN-13无激素液体培养基中于30-35℃暗培养8h，然后向其中加入等体积的含4％质量浓度的蔗糖、105mg/L秋水仙素的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，于30-35℃继续暗培养24h，然后用不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基清洗离心，除去秋水仙素，然后加入相同培养基即不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，25℃恒温静置暗培养5天，最后加入不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为13％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，调节小孢子的密度为1个花蕾/mL，在25℃恒温静置暗培养至胚状体产生；采用该方法培养基及培养条件及培养步骤能在很大程度上提高小孢子胚状体的诱导率而不需要鉴定小孢子的膨大率。
2、本发明在小孢子植株的培养过程中，采用含0.8％质量浓度的琼脂，3％质量浓度的蔗糖，0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤，0.5％质量浓度的活性炭，0.02mg/L NAA且pH5.8-6.0的B5固体培养基中，置于22℃、16h光周期培养箱内培养，该培养基更适合于采用上述诱导方法诱导得到的胚状体再生为植株。
本发明通过对小孢子胚状体诱导条件进行摸索研究，寻找到了一种诱导率高的小孢子胚状体诱导方法，并通过对该胚状体再生植株的培养条件进行研究寻找到了最适合的小孢子植株再生条件。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行进一步详细的叙述。
实施例1
一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法，具体包括如下步骤：
步骤一、游离小孢子的制备：在大田中选取开花3-7天的甘蓝型油菜花序，选择3.2mm的花蕾，将其放入滤布中，在无菌条件下用70％质量浓度的酒精消毒1min，然后用0.1％质量浓度的升汞消毒10min，无菌水冲洗3-5次，经清洗和灭菌后的花蕾放入pH为5.9、含13％质量浓度的蔗糖的B5无激素液体培养基中，轻压挤出小孢子，经300目尼龙网膜过滤到离心管里，于800rpm离心8min，去掉上清液；再加入相同的B5无激素液体培养基在同样转速下离心5min，去掉上清液，即得游离小孢子；
步骤二、小孢子胚状体的诱导：将制备好的甘蓝型油菜小孢子加入含16％质量浓度的蔗糖的NLN-13无激素液体培养基中于33℃暗培养8h，然后向其中加入等体积的含4％质量浓度的蔗糖、105mg/L秋水仙素的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)，于33℃继续暗培养24h，然后用不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)清洗离心，除去秋水仙素，然后加入相同培养基即不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)，25℃恒温静置暗培养5天，最后加入不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为13％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，调节小孢子的密度为1个花蕾/mL，在25℃恒温静置暗培养至胚状体产生；
步骤三、小孢子植株的培育：将产生胚状体的小孢子置于80rpm的摇床上、25℃条件下暗培养10天，然后将正常发育的小孢子胚转入含0.8％质量浓度的琼脂，3％质量浓度的蔗糖，0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤，0.02mg/L NAA且pH5.9的B5固体培养基中，置于22℃、16h光周期培养箱内培养，2周转换一次培养基直到植株生长成为正常不定芽苗，然后再转生根培养基和盆栽驯化，最后移栽大田。
实施例2
一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法，具体包括如下步骤：
步骤一、游离小孢子的制备：在大田中选取开花3-7天的甘蓝型油菜花序，选择3.5mm的花蕾，将其放入滤布中，在无菌条件下用70％质量浓度的酒精消毒1min，然后用0.1％质量浓度的升汞消毒10min，无菌水冲洗3-5次，经清洗和灭菌后的花蕾放入pH为5.9、含13％质量浓度的蔗糖的B5无激素液体培养基中，轻压挤出小孢子，经300目尼龙网膜过滤到离心管里，于800rpm离心8min，去掉上清液；再加入相同的B5无激素液体培养基在同样转速下离心5min，去掉上清液，即得游离小孢子；
步骤二、小孢子胚状体的诱导：将制备好的甘蓝型油菜小孢子加入含16％质量浓度的蔗糖的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)中于35℃暗培养8h，然后向其中加入等体积的含4％质量浓度的蔗糖、105mg/L秋水仙素的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)，于35℃继续暗培养24h，然后用不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)清洗离心，除去秋水仙素，然后加入相同培养基即不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)，25℃恒温静置暗培养5天，最后加入不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为13％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)，调节小孢子的密度为1个花蕾/mL，在25℃恒温静置暗培养至胚状体产生；
步骤三、小孢子植株的培育：将产生胚状体的小孢子置于80rpm的摇床上、25℃条件下暗培养1-2周，然后将正常发育的小孢子胚转入含0.8％质量浓度的琼脂，3％质量浓度的蔗糖，0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤，0.02mg/L NAA且pH5.8-6.0的B5固体培养基中，置于22℃、16h光周期培养箱内培养，2周转换一次培养基直到植株生长成为正常不定芽苗，然后再转生根培养基和盆栽驯化，最后移栽大田。
实施例3
一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法，具体包括如下步骤：
步骤一、游离小孢子的制备：在大田中选取开花3-7天的甘蓝型油菜花序，选择3.5mm的花蕾，将其放入滤布中，在无菌条件下用70％质量浓度的酒精消毒1min，然后用0.1％质量浓度的升汞消毒10min，无菌水冲洗3-5次，经清洗和灭菌后的花蕾放入pH为5.9、含13％质量浓度的蔗糖的B5无激素液体培养基中，轻压挤出小孢子，经300目尼龙网膜过滤到离心管里，于800rpm离心8min，去掉上清液；再加入相同的B5无激素液体培养基在同样转速下离心5min，去掉上清液，即得游离小孢子；
步骤二、小孢子胚状体的诱导：将制备好的甘蓝型油菜小孢子加入含16％质量浓度的蔗糖的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)中于35℃暗培养8h，然后向其中加入等体积的含4％质量浓度的蔗糖、105mg/L秋水仙素的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)，于35℃继续暗培养24h，然后用不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)清洗离心，除去秋水仙素，然后加入相同培养基即不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)，25℃恒温静置暗培养5天，最后加入不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为13％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)，调节小孢子的密度为1个花蕾/mL，在25℃恒温静置暗培养至胚状体产生；
步骤三、小孢子植株的培育：将产生胚状体的小孢子置于80rpm的摇床上、25℃条件下暗培养1-2周，然后将正常发育的小孢子胚转入含0.8％质量浓度的琼脂、3％质量浓度的蔗糖、0.5％质量浓度的活性炭、0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤、0.02mg/L NAA且pH5.8-6.0的B5固体培养基中，置于22℃、16h光周期培养箱内培养，2周转换一次培养基直到植株生长成为正常不定芽苗，然后再转生根培养基和盆栽驯化，最后移栽大田。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。