马蹄肾动物模型的创建方法与流程

本发明是关于一种马蹄肾动物模型的创建方法，具体而言，本发明是关于一种通过给孕期动物注射视黄酸来构建马蹄肾动物模型的方法。

背景技术：

先天性肾脏和尿路异常(congenital anomalies of the kidney and urinary tract，CAKUT)包括胚胎肾脏发育过程中的各种结构畸形。CAKUT占全部先天性畸形的20％-30％，国外文献报告CAKUT的患病率为3‰-6‰；国内回顾性分析近7年北京市140余万胎婴儿出生缺陷的监测资料，发现北京市先天性肾脏畸形所占比例为1.25‰。欧洲透析登记数据显示CAKUT是儿童终末期肾病的主要原因，约41.3％的儿童接受了肾脏替代治疗。欧洲有＞20万病人经历过肾移植，其中CAKUT患者肾移植的中位年龄是31岁，非CAKUT患者的中位年龄是61岁。提示CAKUT是常见的、有害的。

马蹄肾是CAKUT的一种，是最常见的先天性肾脏融合畸形。90％以上的马蹄肾患者表现为下极融合，以肾实质或纤维组织构成峡部。马蹄肾常常合并泌尿系感染、结石、肾积水、肾囊肿、肾肿瘤以及肾小球疾病等并发症。由于肾脏结构复杂，外科手术及内科经皮肾活检等操作困难，甚至用常规的同位素肾图评价马蹄肾的肾小球滤过率都严重低估、不准确。长期以来，对于马蹄肾的发生发展机制及药物和手术的干预研究没有突破性进展，其重要原因是没有适合的马蹄肾动物模型。由于没有马蹄肾的动物模型，至今发病机制不清、缺乏有效的干预措施。因此，创建马蹄肾的动物模型，研究其发生发展的详细过程和确切的分子机制，对于解密马蹄肾等CAKUT的形成机制、最终减少CAKUT等出生缺陷的发生，具有重要的意义。

文献“Robo2调控小鼠肾脏发育信号通路机制的研究”(刘颖，《南昌大学》2013年)记载了孕鼠喂食视黄酸后胚肾和输尿管发育异常，肾脏体积减小，肾脏肾盂扩张，输尿管弯曲扩张畸形，输尿管与肾脏连接异常，输尿管与膀胱连接异常，还可出现“马蹄肾”畸形。其中出现马蹄肾畸形纯属偶然，按照该文献记载的方法重复实验，出现马蹄肾畸形的概率低，重复性差。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种马蹄肾动物模型的创建方法，为马蹄肾的机制研究提供技术平台，为有效治疗马蹄肾提供科学依据。

本案发明人在研究中发现，在小鼠受孕的特定时间点，给孕鼠一次性注射特定浓度和剂量的视黄酸溶液，可诱发马蹄肾。受孕时间过早或过晚、视黄酸剂量过少或过大，都不会形成马蹄肾。

据此，本发明提供了马蹄肾动物模型的创建方法，该方法包括：

在受孕动物的妊娠早期一次性注射一定量的视黄酸溶液，饲养分娩，得到马蹄肾动物模型。

视黄酸是维生素A的活性代谢产物，视黄酸过量或严重缺乏可以导致马蹄肾在内的多种畸形，甚至死胎。这在国内外早有报告，但均具有偶然性。本案发明人通过大量的实验研究，使原来的“视黄酸可能诱发马蹄肾”这一意外的、不可控、不能量化、不能重复的客观“现象”，变成一种可控、可量化、可重复的马蹄肾动物模型的创建方法。

根据本发明的具体实施方案，本发明的马蹄肾动物模型的创建方法中，所述动物选自：小鼠或大鼠。

本发明的具体实施方案表明，在小鼠受孕的特定时间点给孕期小鼠注射特定量的视黄酸可以导致胎鼠马蹄肾，且重复性好，为马蹄肾的机制研究提供了新的技术平台。此外，本发明的技术也可以采用与小鼠类似的方法，构建大鼠的马蹄肾模型。本发明的技术可为外科手术和药物干预提供便于操作和评价的动物模型，为有效治疗马蹄肾提供科学依据。

在本发明的一具体实施方案中，所述动物为小鼠或大鼠，本发明的马蹄肾动物模型的创建方法中，可在母鼠怀孕第6.5～10.5天，一次性注射视黄酸溶液12.5～50mg/kg，创建视黄酸诱发马蹄肾小鼠或大鼠模型。优选地，所述动物为小鼠，在母鼠怀孕第8～9天一次性注射视黄酸溶液20～30mg/kg，创建视黄酸诱发马蹄肾小鼠模型。更优选地，在小鼠怀孕第8.5天一次性注射视黄酸溶液。更优选地，创建视黄酸诱发马蹄肾小鼠模型时，一次性注射视黄酸溶液25mg/kg。

换而言之，本发明还提供了视黄酸在采用上述方法创建马蹄肾动物模型中的应用。具体应用时，视黄酸是配制成特定浓度的视黄酸水溶液，按照特定量在受孕动物的妊娠早期一次性注射给予动物。之后按照常规饲养分娩，即可得到马蹄肾动物模型。

另一方面，本发明还提供了一种马蹄肾，其是按照上述本发明的方法创建马蹄肾动物模型而得到的。

本发明的马蹄肾动物模型的创建方法，实验重复性好。

综上所述，本发明提供了一种马蹄肾动物模型的创建方法，可高效率重复性创建视黄酸诱发马蹄肾的动物模型，为马蹄肾等肾脏发育异常提供用于机制研究的实验工具和平台，为肾脏发育异常或畸形及其出现合并症或并发症时的外科手术操作及药物评价提供与人极为接近的、便利的实验工具平台和科学依据。

附图说明

图1A显示了视黄酸所致马蹄肾的小鼠模型的马蹄肾，图1B为正常对照。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

在进行动物实验前，实验用动物均通过实验动物伦理委员会批准。

实施例、视黄酸诱发马蹄肾小鼠模型的创建与完善

1)选用8周龄性成熟ICR小鼠，每笼4雌1雄，使雌雄交配。每天检查雌鼠，如发现雌鼠有阴道栓，视为妊娠，做好标识、记录妊娠时间，转为单笼饲养。

2)将妊娠的雌鼠根据时间顺序，依时分为3个大组、9个小组，分别在母鼠怀孕第6.5天、8.5天和10.5天，一次性腹腔注射视黄酸溶液(分三个剂量12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg)。做好小鼠注射视黄酸的时间和剂量标志。

3)在母鼠怀孕第17天时解剖孕鼠取出胎鼠，观察胎鼠肾脏形态及全身各器官大体形态，并做好记录。结果如图1A和图1B以及表1所示。图1A显示了视黄酸所致马蹄肾的小鼠模型的马蹄肾，图1B为正常对照。以在受孕小鼠的妊娠第8.5天，一次性注射25mg/kg的视黄酸溶液，单纯马蹄肾的成模率最高。在受孕时间过早或过晚给予视黄酸、或视黄酸剂量过少或过大，都不容易形成单纯的马蹄肾，时间过早或剂量过大容易导致双肾缺失或无脑等严重畸形及死胎。

表1视黄酸诱发马蹄肾小鼠模型的造模情况

最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。