本发明属于微生物技术领域，涉及竹红菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法及其应用。
背景技术：
番茄灰霉病是由一种植物病原性真菌引起的世界性病害，其致病菌是属于半知菌亚门的灰葡萄孢(B.cinerea)。该病菌主要危害番茄的花、果和茎叶，引起果实和叶片腐烂，导致番茄大范围减产，一般可减产20％～30％，严重时可减产50％，从20世纪80年代开始蔓延至我国。
化学防治方法具有防治范围广、防治速度快、防治操作简便等优点，所以传统的防治方法依然以化学农药为主。防治番茄灰霉病的常见化学农药主要有苯并咪唑类、N-苯基氨基甲酸酯类、苯胺基嘧啶类以及二甲酰胺类杀菌剂。苯并咪唑类杀菌剂主要有多菌灵、甲基托布津、噻菌灵等，这类杀菌剂应用较早，它的的作用机理是药剂结合番茄灰霉病病菌的微管蛋白，影响其正常功能，抑制菌丝体的生长与分隔，从而使细胞不能进行正常的有丝分裂和形态建成；N-苯基氨基甲酸酯类杀菌剂包括霜霉威和乙霉威，这类杀菌剂主要通过抑制病菌菌丝体微管蛋白的活性，影响菌丝体正常有丝分裂来达到防治效果；苯胺基嘧啶类杀菌剂包括嘧菌环胺、嘧菌胺、嘧霉胺，这类杀菌剂可以通过抑制菌丝体分泌胞外蛋白酶以及抑制蛋氨酸的合成来达到防治效果；二甲酰胺类杀菌剂包括异菌脲、腐霉利、乙烯菌核利，这类杀菌剂可以影响菌丝体细胞膜的通透性，从而影响细胞活性，达到防治效果。虽然化学防治具有其不可比拟的优势，但是由于大量使用单一化学农药以及灰霉病菌繁殖速度快，易遗传变异等原因，导致灰霉病菌已对多种化学农药产生抗药性。虽然化学农药产品在不断更新，但化学防治的效果依然在逐步减弱。
生物防治是一种新型的防治方法，与传统的化学防治相比，具有绿色、安全、可持续等优点，符合人与自然和谐相处的理念，引起众多科学家的关注，一些新型有效的防治方法也逐渐出现在大众视线，与化学防治共同发挥作用，并逐步取代化学防治的地位。
竹红菌素是我国率先研究的一类天然光敏剂，我国对其研究历史已超30多载，上世纪80年代，研究主要围绕在其结构和物理化学性质等方面，90年代，主要围绕在光动力治疗肿瘤以及结构修饰方面，进入21世纪后，又展开了治疗微血管疾病方面的研究，而关于将其开发为生物农药，防治农林类病害方面的研究却鲜有报道。随着化学农药的滥用，许多害虫和病原菌已逐渐产生抗药性，开发高效、低毒、绿色、环保的生物农药已成为研究者们竞相研究的热门课题。
中国专利文献公开了一种高纯度竹红菌甲素的制备方法[申请号：200610011072.1]，是从竹红菌或竹黄菌中药材中提取并通过分离、结晶、洗涤、萃取、干燥等工艺及产品纯度分析得到高纯度竹红菌甲素，可用于支撑软膏剂、酊剂、气雾剂、片剂、胶囊剂和注射剂等多种剂型。但没有提供应用于抑制番茄灰霉病菌的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种竹红菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法。
本发明的另一目的是提供竹红菌甲素对抑制番茄灰霉病菌的应用。
本发明的再一目的是提供竹红菌甲素对在光化农药中的应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：一种竹红菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法，将竹红菌甲素溶液与番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物体接触。
在上述的竹红菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，所述的竹红菌甲素溶液喷洒在番茄灰霉病菌上和/或感染番茄灰霉病菌的物体上。
在上述的竹红菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物体浸泡在竹红菌甲素溶液中。
在上述的竹红菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，当竹红菌甲素溶液与番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物体接触时，对番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物体在12000LX光强下光照10-24h。
在上述的竹红菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，所述的竹红菌甲素溶液的制备方法是：将竹黄子座用无水酒精浸泡，过滤固体杂质得到提取液，提取液浓缩制得竹红菌甲素浸膏，竹红菌甲素浸膏稀释得到竹红菌甲素溶液。
在上述的竹红菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，所述的竹黄子座用无水酒精浸泡12小时以上，竹红菌甲素浸膏稀释成浓度为10-100mg/L的竹红菌甲素溶液。
在上述的竹红菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，所述的竹红菌甲素浸膏先用无水乙醇稀释后制成竹红菌甲素母液，再用含5％乙醇的0.05mol/L PBS缓冲液稀释成浓度为10-100mg/L，pH值为6.0、7.0或7.2的竹红菌甲素溶液。
在上述的竹红菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，所述的竹红菌甲素溶液的浓度为40mg/L，pH值为7.2。
竹红菌甲素在抑制番茄灰霉病菌中的应用。
竹红菌甲素在光活化农药中的应用。
与现有的技术相比，本发明的优点在于：
1、HA处理番茄灰霉病菌时HA可以进入菌丝，且充满菌丝，能明显抑制番茄灰霉病菌SOD抗氧化酶的活性，能导致番茄灰霉病菌细胞膜通透性发生改变，引起胞内蛋白与可溶性还原糖外泄，细胞膜遭到损伤，能引发番茄灰霉病菌膜脂质过氧化，从而对番茄灰霉病菌起到抑制作用。
2、HA作为一种新型天然光敏剂，兼具化学成分单一、原料易得易纯化、光毒性高且暗毒性低、三重态量子产率高、单重态氧量子产率高等优点，加之其源于自然，不引起土壤污染，对环境安全无公害，能开发为绿色光活化农药，符合环境友好型社会的发展需求与趋势。
具体实施方式
下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，可以从常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量数据，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
竹红菌甲素(HA)浸膏的制备
取50-100g竹黄子座，加入500mL无水酒精浸泡10-24h，优选12小时以上，。用定性滤纸过滤酒精浸提液，优选过滤4次，用旋转蒸发仪减压蒸发酒精，浓缩制得HA浸膏。
HA溶液的配制：取一定量HA浸膏，加少量的无水乙醇作为溶剂，制成HA母液。用紫外分光光度计测465nm下的吸光值，参照[黄小波.药用真菌竹黄的液态发酵工艺优化及竹红菌素的提取研究.浙江：浙江农林大学，2010]HA标准回归方程，算出HA含量。用含5％乙醇的0.05M PBS缓冲液(除CAT活性测定pH 7.0，POD测定pH 6.0，其他均pH 7.2)将HA母液分别稀释成10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的HA溶液，优选地，HA溶液稀释至40mg/L。
将上述的HA溶液喷洒到竹红菌甲素溶液与番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物体上，对番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物体在12000LX光强下光照10-24h。
对比例1
在本对比例中含5％乙醇的0.05M PBS缓冲液替代HA溶液，将缓冲液喷洒到竹红菌甲素溶液与番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物体上，对番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物体在12000LX光强下光照10-24h。
应用例1
培养基的制备
PDA固体培养基：称取200g去皮土豆切成大小均匀的小块，加1.5L水煮沸15～20min，用4层纱布过滤取滤液，加入葡萄糖20g，琼脂20g，趁热搅拌均匀，使琼脂完全溶解，用水补足至总体积为1L，pH自然。把培养基分装至锥形瓶，用压力蒸汽灭菌器在121℃条件下灭菌20min。PDA液体培养基：PDA固体培养基配置过程中不加琼脂。
番茄灰霉病菌菌丝体的制备
将番茄灰霉病菌平板26℃恒温培养4天后，用4mm孔径的无菌打孔器打取平板上生长旺盛的同一圆周的菌饼，接到液体PDA培养基中，26℃，120rpm摇床培养4天。将菌丝球取出，用无菌水淋洗2次，洗去菌丝球上粘上的培养基，得到菌丝体。
番茄灰霉病菌菌丝对HA吸收的测定
挑取少量PDA平板上生长的番茄灰霉病菌菌丝在40mg.L-1的HA溶液中静置30min，以5％乙醇PBS缓冲液替代HA溶液作为对照组。轻轻用无菌水洗去粘在菌丝上的HA，在载玻片上滴一滴无菌水，挑取少量菌丝置于载玻片中，盖上盖玻片，用于观察HA吸收情况。HA在一定波长的光源激发下，可以产生荧光，利用这一特性选择激光共聚焦显微镜进行观察，激发光源选择绿色氦氖激光器，分别采集微分干涉相差图像(DIC)，荧光图像和二者相叠加的图像用于分析。
结果分析：未经HA处理的菌丝，经激光共聚焦显微镜观察，未见荧光。而经HA处理的菌丝，在激发光源的照射下，产生了明显的荧光。且整根菌丝充满了荧光。由于HA在一定波长的光源激发下，可以产生荧光，说明HA已被番茄灰霉菌丝所吸收，并且进入到菌丝内部。本应用例观察到的荧光现象进一步证明了HA可以通过破坏细胞膜，进入细胞内部，继而引发细胞内部发生生理生化变化。
应用例2
称取2g菌丝，放入150mL的锥形瓶中，每瓶锥形瓶加30mL40mg.L-1的HA溶液，以30mL含5％的乙醇PBS缓冲液替代HA溶液作为对照组，设置处理时间为0h、6h、12h、24h、36h。每组时间梯度设3组重复。放入恒温光照培养箱，26℃，12 000LX光强进行光照。在光照后取出锥形瓶，4℃，8 000rpm离心10min，获得菌丝，用无菌水淋洗菌丝2次。将菌丝置于研钵中，液氮研磨至菌丝呈均匀糊状，加入4mL 0.05M pH 7.2的PBS缓冲液，4℃，10 000rpm离心20min。取2mL上清液加入2mL含0.67％TBA的质量分数为10％的三氯乙酸(TCA)，混合均匀后，放置在100℃的沸水浴中水浴15min，取出后快速置于冰浴中冷却至反应终止。测定混合液在450、532、600nm处的吸光值，经公式(2.1)算出MDA浓度。公式中C表示MDA浓度，单位μmol.L-1。
C＝6.45(OD532-OD600)-0.56OD450(2.1)
结果分析：用40mg.L-1的HA处理番茄灰霉病菌，随着处理时间的延长，菌丝、培养液、菌丝+培养液的MDA含量均呈上升趋势。在处理12h时，与0h相比，差异显著(P<0.5)。在处理24～36h后，菌丝+培养液的MDA含量较高，与0h、6h、12h相比，差异均为显著(P<0.5)。这表明HA诱导了番茄灰霉病菌细胞膜脂质过氧化，造成膜损伤，改变膜通透性，导致了MDA流出细胞。
应用例3
设置HA处理浓度为10mg.L-1、20mg.L-1、40mg.L-1、60mg.L-1、80mg.L-1、100mg.L-1，以30mL含5％的乙醇PBS缓冲液替代HA溶液作为对照组，每组浓度设3组重复。称取2g菌丝(见2.2.1)，放入150mL的锥形瓶中，每瓶锥形瓶加30mL的HA溶液。放入恒温光照培养箱，26℃，12 000LX光强光照24h。在光照后取出锥形瓶，4℃，8 000rpm离心10min，获得菌丝，用无菌水淋洗菌丝2次。菌丝及培养液中MDA含量测定方法同上。
结果分析：随着HA浓度的升高，菌丝、培养液、菌丝+培养液的MDA含量均呈上升趋势。在HA浓度为0mg.L-1、10mg.L-1、20mg.L-1、40mg.L-1时，培养液、菌丝+培养液的MDA含量各浓度间差异显著(P<0.5)。各HA浓度与0mg.L-1相比，差异均显著(P<0.5)。HA浓度为10mg.L-1时，与0mg.L-1相比，菌丝MDA含量差异不显著(P>0.5)，高于10mg.L-1的菌丝MDA含量与0mg.L-1相比，差异显著。在HA浓度为100mg.L-1时，MDA含量达到最高，与60mg.L-1相比，差异显著，且培养液中MDA含量显著高于菌丝中的含量。这表明HA可能诱导了番茄灰霉病菌细胞膜脂质过氧化，造成膜损伤，改变膜通透性，导致了MDA流出细胞，HA浓度越高，对菌丝的脂质过氧化反应越明显。
应用例4
HA处理不同时间后番茄灰霉病菌胞内蛋白质含量的测定：称取1g菌丝，放入150mL的锥形瓶中，每瓶锥形瓶加30mL 40mg.L-1的HA溶液，以30mL含5％的乙醇PBS缓冲液替代HA溶液作为对照组，设置处理时间为0h、3h、6h、12h、24h、36h。每组时间梯度设3组重复。将锥形瓶放入恒温光照培养箱，26℃，12 000LX光强进行光照。在光照后取出锥形瓶，4℃，8000rpm离心10min，获得菌丝。用无菌水淋洗菌丝2次。将菌丝置于研钵中，液氮研磨至菌丝呈均匀糊状，用0.05M pH 7.2的PBS缓冲液定容至10mL，4℃，10 000rpm离心10min，取上清液进行测定。
结果分析：未经HA处理的菌丝胞内蛋白质含量各处理时间差异不显著。用40mg.L-1的HA处理番茄灰霉病菌，随着处理时间的延长，蛋白质含量呈下降趋势。菌丝经HA处理6h时，菌丝胞内蛋白质含量与0h相比，差异不显著(P>0.5)，分别为0.177gprot.L-1和0.187gprot.L-1，是由于处理时间较短，HA还未对细胞膜的通透性造成显著影响。在处理12h时，与0h相比，差异显著(P<0.5)。在处理24h后，胞内蛋白质含量较低，与0h、3h、6h、12h相比，差异均为显著(P<0.5)。在36h时，胞内蛋白质含量达到最低，与对照组相比，降低了37.0％。这表明胞内蛋白质明显泄漏，HA破坏了细胞膜，使通透性发生变化，造成胞内的蛋白质渗漏到胞外，在0～36h，HA处理时间越长，菌丝胞内蛋白质含量下降越明显。
应用例5
不同浓度HA处理后番茄灰霉病菌胞内蛋白质含量的测定:设置HA处理浓度为10mg.L-1、20mg.L-1、40mg.L-1、60mg.L-1、80mg.L-1、100mg.L-1，以30mL含5％的乙醇PBS缓冲液替代HA溶液作为对照组，每组浓度设3组重复。称取1g菌丝(见2.2.1)，放入150mL的锥形瓶中，每瓶锥形瓶加30mL的HA溶液。放入恒温光照培养箱，26℃，12 000LX光强光照24h。24h后取出锥形瓶，4℃，8 000rpm离心10min，获得菌丝。用无菌水淋洗菌丝2次。将菌丝置于研钵中，液氮研磨至菌丝呈均匀糊状，用0.05M pH 7.2的PBS缓冲液定容至10mL，4℃，10000rpm离心10min，取上清液进行测定。蛋白质测定方法同上。
结果分析：随着HA浓度的升高，胞内蛋白质含量呈下降趋势。在HA浓度为10mg.L-1时，与0mg.L-1相比，差异不显著(P>0.5)，是由于HA浓度较低，HA还未对细胞膜的通透性造成显著影响，细胞在低浓度HA刺激下，细胞生产更多蛋白质以抵御外界不良环境。在HA浓度为20mg.L-1、40mg.L-1、60mg.L-1、80mg.L-1、100mg.L-1时，与0mg.L-1相比，差异显著(P<0.5)。在HA浓度为100mg.L-1时，蛋白质含量达到最低，与0mg.L-1相比，降低了81.0％。这表明胞内蛋白质明显泄漏，HA破坏了细胞膜，使通透性发生变化，造成胞内的蛋白质渗漏到胞外，HA浓度越高，菌丝胞内蛋白质含量下降越明显。
实施例6
HA对番茄灰霉病菌SOD活性的影响：称取1g菌丝，放入150mL的锥形瓶中，每瓶锥形瓶加30mL 40mg.L-1的HA溶液，以30mL含5％的乙醇PBS缓冲液替代HA溶液作为对照组，设置处理时间为0h、3h、6h、12h、24h、36h。每组时间梯度设3组重复。
结果分析：未经HA处理的番茄灰霉病菌SOD活性各处理时间之间差异不显著。用40mg.L-1的HA处理番茄灰霉病菌，随着处理时间的延长，SOD活性呈下降趋势。在处理24h后，SOD活性较低，与0h、3h、6h、12h相比，差异均为显著(P<0.5)。在36h时，SOD活性下降到最低，比对照组降低了27.7％。这表明HA抑制了SOD活性，使SOD活性降低，不能及时清除细胞中超氧阴离子，导致超氧阴离子在细胞中积累，对细胞造成毒性，从而对番茄灰霉病菌产生一定影响，在0～36h，HA处理时间越长，对菌丝SOD抑制作用越明显。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。