本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单环刺螠精子冷冻保存液及其制备方法。
背景技术：
在水产增养殖生产中，随着人工授精技术的发展和种质资源保护的需要,水产经济动物的精子体外保存技术研究日益受到关注。精子的体外保存可解决雌、雄成熟不同步问题，同时也降低了饲养大量亲本所需的花费,对人工繁育、种质优选及精子代谢和生理等研究提供了技术平台。单环刺螠肉味鲜美、营养丰富、价格适中，被称为“裸体海参”，市场需求量不断增加。近年来还发现单环刺螠体内存在多种生物活性肽，具有抗肿瘤、抗菌、免疫调节等功能。单环刺螠对海水中有害物质硫化物有较强的耐受与解毒能力，可对调节水质、缓解海洋污染起到一定积极的作用。由于过度捕捞导致单环刺螠的天然资源量锐减，已远远不能满足人类的需求，因此亟待开展单环刺螠的人工增养殖。在单环刺螠人工繁殖生产中，如何同时获取高质量的成熟精卵是一个主要问题。
原有专利技术已涉及到鱼类(太平洋鳕鱼、云斑尖塘鳢、棘头梅童鱼、斑点叉尾鮰、小黄鱼、黄鳝等)和少数贝类(魁蚶、香港牡蛎等)，迄今尚无关于单环刺螠精子保存技术的专利。单环刺螠(Urechis unicinctus)隶属于螠虫动物门、螠纲、无管螠目、刺螠科，俗称海肠。由于不同种类动物的精子具有不同的生物学特性，所以原有技术不适宜用于单环刺螠精子的保存。
技术实现要素：
为克服上述问题，本发明的目的在于提供一种单环刺螠精子冷冻保存液。
本发明的技术方案是通过下列方式实现的：
一种单环刺螠精子冷冻保存液，包括单环刺螠精子、保存剂与抗冻剂。
优选的，所述保存液pH为4-11，更优选6-9，进一步优选8-9，特别优选8。
优选的，所述保存液的盐度为10-40，更优选20-35，进一步优选25-35，特别优选25-30。
优选的，所述保存剂包括中性盐与弱碱性盐。更优选的，所述中性盐选自钠盐、钾盐、钙盐或镁盐中的一种或多种。进一步的，所述中性盐选自NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2，Na2SO4，K2SO4，MgCl2.6H2O，MgCl2或NaH2PO4中的一种或多种，优选NaCl，KCl和CaCl2中的一种或多种，更优选的，所述中性盐为NaCl，KCl和CaCl2的混合物，进一步优选的，所述混合物中NaCl，KCl和CaCl2的质量比为2500：20：21。
优选的，所述弱碱性盐选自NaHCO3，或KHCO3，更优选的，所述中性盐为NaCl，KCl和CaCl2的混合物，所述CaCl2与NaHCO3的质量比为10:1。
优选的，所述抗冻剂选自二甲基亚砜和/或甘油，更优选10％-15％V/V二甲基亚砜或5％-10％V/V甘油，进一步优选10％V/V二甲基亚砜或5％V/V甘油。
优选的，所述保存液进一步被冻干。
本发明的另一目的还在于提供一种制备所述单环刺螠精子冷冻保存液的方法，包括取材，精子活力鉴定，精子稀释，降温平衡，第一次预冷，第二次预冷，保存，解冻和洗脱步骤。
优选的，本发明的冷冻保存液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取材：取单环刺螠成熟雄体，75％乙醇擦拭肾孔周围体表，从肾孔吸取精液，置于广口瓶中；
(2)精子活力鉴定：显微镜观察，镜检单环刺螠精子激活率达到85％以上；
(3)精子稀释：加入精子保存剂，稀释成精子悬浮液；
(4)降温平衡：于稀释后精液中添加抗冻剂，震荡混匀，分装至冻存管中，于冷藏箱中降温平衡；
(5)第一次预冷：在保温瓶中放入支架，加入液氮，在装有精子的冻存管平铺于保温瓶中的平筛网表面，盖上保温瓶盖；
(6)第二次预冷：打开保温瓶盖，向保温瓶中添加液氮，使液氮面接近平筛网面，盖上保温瓶盖；
(7)保存：取出冻存管，迅速将其放入液氮罐中保存；
任选的，还包括(8)解冻和洗脱步骤：当需要使用所保存的精子标本时，打开液氮罐，将冻存管拎出，迅速放入水浴中解冻后，加入精子保存剂，震荡混匀，离心，取得精子沉淀镜检后用于人工授精。
进一步优选的，所述制备方法包括如下步骤：
(1)取材：取单环刺螠成熟雄体，75％乙醇擦拭肾孔周围体表，用吸管从肾孔吸取精液，置于灭菌干燥后的广口瓶中；
(2)精子活力鉴定：用吸管取1滴精液于载玻片上，加上1滴海水制成涂片，显微镜观察，镜检单环刺螠精子激活率达到85％以上，可以用于冷冻保存；
(3)精子稀释：加入相对于精液体积的20倍精子保存剂，稀释至106个mL的精子悬浮液；
(4)降温平衡：于稀释后精液中添加抗冻剂，震荡混匀，分装至1.8mL冻存管中，于4℃冷藏箱中降温平衡30min；
(5)第一次预冷：在保温瓶中放入支架，加入液氮，使液氮面距离平筛网面5cm；在装有精子的冻存管外系上1m长线绳，将冻存管平铺于保温瓶中的平筛网表面，盖上保温瓶盖；
(6)第二次预冷：打开保温瓶盖，向保温瓶中添加液氮，使液氮面接近平筛网面，盖上保温瓶盖；
(7)保存：取出冻存管，迅速将其放入液氮罐中保存；
(8)解冻和洗脱：当需要使用所保存的精子标本时，打开液氮罐，捏住露在液氮罐外的线绳，将冻存管拎出，迅速放入水浴中解冻后，加入精子保存剂，震荡混匀，1000r/min离心5min，取得白色精子沉淀镜检后用于人工授精。
优选的，步骤(1)中单环刺螠置于4℃的广口瓶中备用。
优选的，步骤(3)中精子保存剂包括NaCl，KCl和CaCl2和NaHCO3，其中NaCl，KCl和CaCl2和NaHCO3的质量比为25.00：20：21：2.1，更优选的，保存剂包括NaCl 25.00g，KCl 0.20g，CaCl2 0.21g，NaHCO3 0.021g，将上述保存剂溶于1L蒸馏水中；进一步优选的，步骤(3)中蒸馏水的pH调至8。
优选的，步骤(4)中抗冻剂成分为10％V/V二甲基亚砜DMSO。
优选的，步骤(5)中支架采用铅丝制成，铅丝制成平筛网，其孔径比冻存管略小，平筛网下部设有三条支柱；进一步优选的，步骤(5)中第一次预冷时间为20min；更进一步优选的，步骤(5)中第二次预冷时间为5min。
优选的，步骤(8)中水浴的温度为38℃，更优选的，步骤(8)中加入精子保存剂的体积为冻精的三倍。
与现有技术相比，本发明是针对单环刺螠精子的生物学特点，筛选出适合单环刺螠精子的冷冻保存方法，可以长期有效地保存单环刺螠精子；实验证明，利用本发明将单环刺螠精子在液氮中保存15d后，解冻后的精子存活率可达70％以上。本方法无需昂贵的仪器设备，操作简单，成本低廉，效果好，为单环刺螠的人工授精工作提供了精子来源保障，并可用于单环刺螠的杂交育种、种质优选、雌核发育及物种保护等其他研究领域。
具体实施方式
为了进一步描述本发明的技术方案及所取得的技术效果，下面将结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护内容并非局限于下列具体实施例。
实施例1
(1)取材：单环刺螠在一年中有2个生殖期：春季(4月中下旬至5月底)和秋季(9月下旬至10月底)，可在此阶段采集成熟的精子。取单环刺螠成熟雄体，75％乙醇擦拭肾孔周围体表，用吸管从肾孔吸取精液，置于灭菌干燥后的广口瓶中，4℃备用。
(2.1)精子活力鉴定方法：用吸管取1滴精液于载玻片上，加上1滴海水制成涂片，显微镜观察。精子激活率以活动精子数量占全部精子数量的百分比计算，统计样品的精子激活率；各实验均重复3次，实验数据用“平均数+标准差”表示；采用SPSS16.0软件进行数据处理，并进行单因子方差分析(One-way ANOVA)，LSD(Least Significant Difference)多重比较和Duncan检验镜，检单环刺螠精子激活率达到85％以上，可以用于冷冻保存。
(2.2)pH对精子活力的影响：取2.5％NaCl溶液，用0.1mol L的NaOH和HCl溶液调节pH至4、5、6、7、8、9、10、11共8个pH梯度，依次为实验1－8组。取新鲜精液，用不同pH的NaCl溶液激活，测其活力。
盐度对精子活力的影响
(2.3)用NaCl和蒸馏水配制10、15、20、25、30、35、40共7个盐度梯度，依次为实验1－7组，各组pH均调节至8。取新鲜精液，用不同盐度的NaCl溶液激活，测其活力。
(2.4)不同精子保存剂对精子冷冻保存的影响：精子保存剂采用下列9种，配方是在参考有关文献中应用于鱼类、虾类、贝类等精子稀释剂的基础上，针对单环刺螠精子的生物学特点修改而成的；各保存剂的pH均调节至8，并加入10％DMSO。
保存剂I：无钙离子人工海水-NaCl 21.63g，NaOH 0.19g，KCl 1.12g，MgSO4.7H2O 4.93g，H3BO3 0.53g，加蒸馏水定容至1000mL；
保存剂II：NaCl 25.00g，Na2SO43.90g，KCl 0.73g，MgCl2.6H2O 10.70g，NaHCO30.23g，加蒸馏水定容至1000mL；
保存剂III：NaCl 25.00g，KCl 0.60g，CaCl2 0.25g，MgCl2 0.35g，NaHCO3 0.20g，加蒸馏水定容至1000mL；
保存剂IV：NaCl 25.00g，KCl 0.20g，CaCl2 0.21g，NaHCO3 0.021g，加蒸馏水定容至1000mL；
保存剂V：NaCl 25.30g，NaH2PO4 0.22g，NaHCO3 0.25g，KCl 0.39g，CaCl2 0.13g，MgCl2.6H2O 0.23g，葡萄糖10g，加蒸馏水定容至1000mL；
保存剂VI：NaCl 8.00g，KCl 1.00g，葡萄糖15.00g，加蒸馏水定容至1000mL；
保存剂VII：过滤海水(盐度25)；
保存剂VIII：NaCl 0.075g，KCl 0.005g，CaCl2 0.001g，NaHCO3 0.002g，加蒸馏水定容至1000mL；
保存剂IX：生理盐水(0.9％NaCl)；
将步骤1中取得的精液分别加入9种相对于精液体积的20倍精子保存剂，稀释至106个mL的精子悬浮液，于4℃冰箱中降温平衡30min，再经两次预冷：第一次样品距液氮表面5cm处，预冷20min，第二次样品于液氮表面预冷5min。然后将装有样品的冻存管放入液氮罐中保存；注意将贴有标签的线绳顶端露在液氮罐外，注明标本名称及冻存时间。
解冻方法：打开液氮罐，捏住露在液氮罐外的线绳，将冻存管拎出，迅速放入38℃水浴中解冻后，加入冻精3倍体积的精子保存剂，震荡混匀，1000r/min离心5min，取得白色精子沉淀用海水激活检测其活力。
不同抗冻剂对精子冷冻保存的影响
在(2.4)所筛选出的最适保存剂的基础上，以二甲基亚砜DMSO和甘油作为冷冻保护剂，设置对照组以及10个不同的保护剂浓度和保护剂组合：实验0组不加抗冻剂；实验1－4组分别含DMSO(V/V)5％、10％、15％、20％；实验5－8组分别含甘油(V/V)5％、10％、15％、20％；实验9组分别含DMSO和甘油各10％；实验10组分别含DMSO和甘油各20％，其余步骤同(2.4)。
(3.1)pH对精子活力的影响：pH对精子活力的影响见表1；从表1中可以看出，单环刺螠精子对酸性环境的耐受力要低于碱性环境。精子激活率以pH8组最高，可达95.61％；其次以pH9组和pH7组激活率较高。随着pH的下降和升高，精子激活率急剧下降，pH11组仅为8.06％，pH4组精子激活率为0。
表1 pH对单环刺螠精子激活率的影响(平均值±标准差)
注：单因子方差分析，表中上标小写不同字母表示不同pH处理组间有显著差异(P<0.05)，下同。
(3.2)盐度对精子活力的影响：从表2可以看出，在不同浓度的NaCl溶液处理下，盐度25和30两组的精子激活率无显著性差异，分别达到92.44％和90.78％；其次为盐度35和20组激活率分别为85.37％和74.76％。当盐度为40或小于等于15时，精子激活率显著下降，盐度10组精子激活率仅为6.85％。
表2 盐度对单环刺螠精子激活率的影响(平均值±标准差)
(3.3)不同精子保存剂对精子冷冻保存的影响：不同保存剂对冷冻保存单环刺螠精子激活率的影响见表3；各组精子初始存活率均为93.16％。平衡30min后，各试验组精子激活率即出现差异：保存剂III、IV、VII、VIII、IX的精子激活率超过80％，其中以保存剂IV组最高，为89.92％；保存剂I、II、V、VI的精子激活率均低于80％，以保存剂II精子激活率最低，仅为59.14％。冷冻保存24h后，以保存剂IV组的解冻后精子激活率最高，达84.83％，其次是保存剂VIII组，解冻后精子激活率达71.18％，以保存剂VI组精子激活率最低，仅为46.51％，降幅达46.65％。
表3 不同保存剂对冷冻保存单环刺螠精子激活率的影响(平均值±标准差)
注：单因子方差分析(One-way ANOVA)和Duncan检验。表中上标不同字母表示组间有显著差异(P<0.05)
(3.4)不同抗冻剂对精子冷冻保存效果的影响：从表4可见，对照组未添加任何抗冻剂直接冷冻，冷冻24h后精子激活率仅为21.53％，保存15d后精子激活率降幅达83.97％。各试验组中，以试验2组(DMSO，10％)的精子激活率最高，冷冻24h后精子激活率达77.15％，保存15d后仍能达到71.28％。其次是试验5组(甘油，5％)，保存15d后的精子激活率为56.69％。
从同一保护剂、不同添加浓度之间的比较发现，DMSO浓度从5％－10％之间，随着DMSO添加量的增加，精子激活率呈现升高趋势，但当DMSO浓度达到15％及以上时，精子激活率明显下降。添加甘油各组精子激活率与甘油浓度呈显著负相关(r＝0.986，P<0.01)。以等比例添加DMSO和甘油的试验9组和10组，其精子激活率均较低，尤其试验10组精子激活率降幅较大，达到66.89％。
表4 不同抗冻剂对冷冻保存单环刺螠精子激活率的影响(平均值±标准差)
注：单因子方差分析(One-way ANOVA)和Duncan检验。表中上标不同字母表示有显著差异(P<0.05)
实施例2
参考实施例1的冷冻液制备方法，完成下列制备工艺：
(1)取材：在4月中下旬至5月底，或9月下旬至10月底，取单环刺螠成熟雄体，75％乙醇擦拭肾孔周围体表，用吸管从肾孔吸取精液，置于灭菌干燥后的广口瓶中，4℃备用；
(2)精子活力鉴定：用吸管取1滴精液于载玻片上，加上1滴海水制成涂片，显微镜观察。精子激活率以活动精子数量占全部精子数量的百分比计算。当镜检单环刺螠精子激活率达到85％以上，进行下述冷冻步骤；
(3)精子稀释：加入相对于精液体积的20倍精子保存剂，稀释至106个/mL的精子悬浮液。所述的精子保存剂配制方法为：NaCl 25.00g，KCl 0.20g，CaCl2 0.21g，NaHCO3 0.021g，溶于1L蒸馏水中，pH调至8；
(4)降温平衡：将精子悬浮液加入抗冻剂15％二甲基亚砜DMSO－V/V分装至1-2mL冻存管中，于4℃冰箱中降温平衡30min；
(5)第一次预冷：在保温瓶中放入冻存管支架，然后向保温瓶中加入液氮，使液氮表面距离冻存管支架表面5cm；将降温平衡处理过的冻存管用顶端贴有标签的长线绳做好标记(注明标本名称及冻存时间)后，平放于冻存管支架上，盖上保温瓶盖，预冷20min；
(6)第二次预冷：打开保温瓶盖，向保温瓶中添加液氮，使液氮面接近平筛网面，盖上保温瓶盖，第二次预冷5min；
(7)冻存：从保温瓶中取出冻存管，迅速将其放入液氮罐中保存，将线绳顶端标签露在液氮罐外；
(8)解冻和洗脱：当需要使用所保存的精子标本时，打开液氮罐，捏住露在液氮罐外的线绳，将冻存管拎出，迅速放入38℃水浴中解冻后，加入冻精3倍体积的精子保存剂，震荡混匀，1000r/min离心5min，取得白色精子沉淀镜检后用于人工授精。
实验例单环刺螠精子冷冻实验。
按实施例2所述的单环刺螠精子冷冻保存方法所述的步骤进行冷冻保存；15d后，打开液氮罐，捏住露在液氮罐外的长线绳，将冻存管拎出，按实施例2步骤(8)所述的方法进行解冻和洗脱，按实施例2步骤(2)所述的方法进行活力检测，检测精子激活率为71％。