本发明属于植物培养领域，具体地说，涉及一种蓝莓组培方法。
背景技术：
蓝莓，也称越橘，是越橘科越橘属(Vaccinium)灌木或小乔木，蓝莓在分类学上属杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium spp.)，是该属多年生落叶或常绿灌木的总称。
蓝莓的营养价值极为丰富，可溶性固形物含量平均12％左右，除常规水果共有的糖、酸外，还含有其它水果所不具备的大量对人体健康有益的物质，如：大量的水溶性酚类色素有15种之多，药理研究发现蓝莓总花色素苷成分具有促进人视网膜上视红素再合成、改善循环、抗溃疡、抗炎症等多种功能。
蓝莓原产于北美，其商业栽培历史仅有100多年，我国虽然在20世纪的50年代就对笃斯蓝莓进行了栽培，但主要用来酿酒，基本没有鲜食的品种。直到80年代才国外引进栽培，而进入21世纪之后，蓝莓产业在我国得到了较快的发展，成为一个新兴的水果产业，在促进农村产业结构、农民增收、农业增效等方面发挥了十分总要的作用。
蓝莓的繁殖主要有种子播种、扦插繁殖、组培繁殖几类。其中种子繁殖存在苗木变异大、进入结果期晚、品种易退化等不利因素；扦插繁殖又存在繁殖系数低、枝条用量大、对树体损害大的弊端；而利用组培技术，则可以克服以上繁殖方法的弊端，达到使用较少的材料，获得比常规育苗繁殖更大量、更优质的种苗，同时可通过组培技术，对蓝莓进行脱毒处理，保证品种不受病毒的浸染及引起的退化，提高了苗木的成活率和生长的整齐度。因此，蓝莓的组培技术是一种见效快、成本低、效果好的繁殖手段，目前已在生产上大量应用。蓝莓组培繁殖的主要过程是通过获得外殖体(健壮的枝条)，经过消毒灭菌后，将外殖体移植到培养基中，建立无菌系，在无菌系建立以后，对其进行增殖及继代培养，当继代培养达到一定规模以后，对其进行生根培养。通过瓶内生根培养或瓶外生根培养，从而培养出符合要求的蓝莓组培苗。
在现有的蓝莓组培技术中，普遍采用单一的培养基，这种技术方法存在的一个重要问题是繁殖系数较低，根据培养基中激素浓度的不同，繁殖系数一般在3～12之间，由于繁殖系数较低，导致了生产效率低，成本较高等问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种蓝莓组培方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种蓝莓组培方法，包括以下步骤：
1)外植体处理：选取当年生营养枝的幼嫩茎段或茎尖，在实验室内先剪去叶片，用蒸馏水将灰尘清洗干净，将茎段或茎尖进行消毒，消毒结束后，将茎段或茎尖剪成2cm的茎段待用；
2)无菌系建立：将消毒后的茎段移入放有固体培养基的广口瓶中，无菌系建立用MS培养基，每瓶培养基数量为30～40ml，每瓶移入的蓝莓茎段或茎尖为8～10个，然后密封，再将培养瓶放进培养室培养；同时要控制好培养室周边的环境，避免外界对组培是的污染；对出现污染的茎段和培养基及时清理；
3)继代增殖：通过60～80天培养保存，蓝莓的无菌系基本建成，此时进入继代培养过程；继代培养所用培养基为WPM培养基，所用激素为玉米素，不另外使用其他激素，激素的浓度为2mg/升，每瓶接入无菌系的茎段2个，每瓶培养基为50ml，密封后放入培养室进行继代培养，每周对培养室进行1次消毒，20～25天更换1次培养基，通过一个周期的继代，每瓶的有效苗达30苗以上，增殖系数达15以上；
4)生根培养：继代结束的组培苗就进入生根培养阶段，生根培养采用瓶内生根方式，培养基采用WPM，激素使用IBA，浓度为0.5mg/L，生根培养25～30天；
5)组培苗的过渡：将生根后的组培苗移入过渡大棚用过渡基质进行过渡，移植时，先将组培苗根上的培养基清洗干净，然后将其移栽在基质上，移植完后盖上小拱棚，过渡培养15～20d。
进一步地，步骤1)中的茎段或茎尖用质量百分浓度为75％的酒精消毒30秒，然后用质量百分浓度为0.05％-0.15％的升汞消毒20～60分钟。
进一步地，步骤2)中的培养室培养条件为：培养室温度控制在24-26℃，光照时间为12小时，光照强度为1000Lx。
进一步地，步骤3)中的继代培养条件为：培养室温度控制在24-26℃，每天光照12小时，关照强度1200Lx。
进一步地，步骤4)中的生根培养条件为：生根培养的温度为25～28℃，光照时间每天12小时，光照强度1400Lx。
进一步地，步骤5)中的过渡培养基质为：质量比例为3-8:1-3:1-3:1的草泥炭、腐殖土、膨胀珍珠岩和红土，基质的PH值调整为5.0～5.5。
进一步地，步骤5)中的小拱棚内温度25～28℃，相对湿度85％～90％，移植后的前5天每隔2h喷雾一次，以后每天喷雾2次。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)与其他的蓝莓组培技术相比，本发明的基本培养基为MS培养基与WPM结合，而不是仅单纯采用WPM培养基，其激素的浓度也进行了优化，促进了不定芽的形成，增殖系数可达到14.6～22.3，大大增加了繁殖数量和节约了生产成本；
2)在组培苗过渡的基质配方上，基质材料采用膨胀珍珠岩、红土、草泥炭、腐殖土等按一定比例配合，用柠檬酸调整PH值到5.0～5.5，然后将组培苗扦插在基质上，扣上小拱棚，保持棚内温度25～28℃，相对湿度85％～90％，经过15～20d的过渡，其生根率可达85％以上，移栽成活率可达90％以上。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明提供一种蓝莓组培方法，包括以下步骤：
1)外植体处理：
选取当年生营养枝的幼嫩茎段或茎尖，在实验室内先剪去叶片，用蒸馏水将灰尘等清洗干净，将茎段或茎尖用质量百分浓度为75％的酒精消毒30秒，然后用质量百分浓度为0.05％-0.15％的升汞消毒20～60分钟(根据外植体成熟程度确定时间，越嫩的枝条或芽消毒时间越短)，消毒结束后，将茎段或茎尖剪成2cm左右的茎段待用；
2)无菌系建立：
将消毒后的茎段移入放有固体培养基的广口瓶中，无菌系建立用MS培养基，每瓶培养基数量为30～40ml，每瓶移入的蓝莓茎段或茎尖为8～10个，然后密封，再将培养瓶放进培养室培养。培养室温度控制在25℃(±1℃)，光照时间为12小时，光照强度为1000Lx。同时要控制好培养室周边的环境，避免外界对组培是的污染。对出现污染的茎段和培养基及时清理。
3)继代增殖：
通过60～80天培养保存，蓝莓的无菌系基本建成，此时可以进入继代培养过程。继代培养所用培养基为WPM培养基，所用激素为玉米素(ZT)，不另外使用其他激素，激素的浓度为2mg/升，每瓶接入无菌系的茎段2个，每瓶培养基为50ml，密封后放入培养室进行继代培养，培养室温度控制在25℃(±1℃)，每天光照12小时，关照强度1200Lx，每周对培养室进行1次消毒，20～25天更换1次培养基，通过一个周期的继代，每瓶的有效苗可达30苗以上。增殖系数可达15以上。
4)生根培养
继代结束的组培苗就进入生根培养阶段，生根培养采用瓶内生根方式，培养基采用WPM，激素使用IBA，浓度为0.5mg/L,生根培养的温度为25～28℃，光照时间每天12小时，光照强度1400Lx，通过25～30天的生根培养，95％的组培苗生根，生根率98％以上。
5)组培苗的过渡
将生根后的组培苗移入过渡大棚进行过渡，过渡用基质为草泥炭、腐殖土、膨胀珍珠岩和红土，其比例为3-8:1-3:1-3:1，基质的PH值调整为5.0～5.5，移植时，先将组培苗根上的培养基清洗干净，然后将其移栽在基质上，移植完后盖上小拱棚，保持棚内温度25～28℃，相对湿度85％～90％，移植后的前5天每隔2h喷雾一次，以后每天喷雾2次，经过15～20d的过渡，其生根率可达85％以上，移栽成活率可达90％以上。
实施例1
一种蓝莓组培方法，包括以下步骤：
1)外植体处理：
选取当年生营养枝的幼嫩茎段或茎尖，在实验室内先剪去叶片，用蒸馏水将灰尘等清洗干净，将茎段或茎尖用质量百分浓度为75％的酒精消毒30秒，然后用质量百分浓度为0.1％的升汞消毒20～60分钟(根据外植体成熟程度确定时间，越嫩的枝条或芽消毒时间越短)，消毒结束后，将茎段或茎尖剪成2cm左右的茎段待用；
2)无菌系建立：
将消毒后的茎段移入放有固体培养基的广口瓶中，无菌系建立用MS培养基，每瓶培养基数量为30～40ml，每瓶移入的蓝莓茎段或茎尖为8～10个，然后密封，再将培养瓶放进培养室培养。培养室温度控制在25℃(±1℃)，光照时间为12小时，光照强度为1000Lx。同时要控制好培养室周边的环境，避免外界对组培是的污染。对出现污染的茎段和培养基及时清理。
3)继代增殖：
通过60～80天培养保存，蓝莓的无菌系基本建成，此时可以进入继代培养过程。继代培养所用培养基为WPM培养基，所用激素为玉米素(ZT)，不另外使用其他激素，激素的浓度为2mg/升，每瓶接入无菌系的茎段2个，每瓶培养基为50ml，密封后放入培养室进行继代培养，培养室温度控制在25℃(±1℃)，每天光照12小时，关照强度1200Lx，每周对培养室进行1次消毒，20～25天更换1次培养基，通过一个周期的继代，每瓶的有效苗可达30苗以上。增殖系数可达15以上。
4)生根培养
继代结束的组培苗就进入生根培养阶段，生根培养采用瓶内生根方式，培养基采用WPM，激素使用IBA，浓度为0.5mg/L,生根培养的温度为25～28℃，光照时间每天12小时，光照强度1400Lx，通过25～30天的生根培养，95％的组培苗生根，生根率98％以上。
5)组培苗的过渡
将生根后的组培苗移入过渡大棚进行过渡，过渡用基质为草泥炭、腐殖土、膨胀珍珠岩和红土，其比例为5:2:2:1，基质的PH值调整为5.0～5.5，移植时，先将组培苗根上的培养基清洗干净，然后将其移栽在基质上，移植完后盖上小拱棚，保持棚内温度25～28℃，相对湿度85％～90％，移植后的前5天每隔2h喷雾一次，以后每天喷雾2次，经过15～20d的过渡，其生根率可达85％以上，移栽成活率可达90％以上。
实施例2
一种蓝莓组培方法，包括以下步骤：
1)外植体处理：
选取当年生营养枝的幼嫩茎段或茎尖，在实验室内先剪去叶片，用蒸馏水将灰尘等清洗干净，将茎段或茎尖用75％的酒精消毒30秒，然后用0.15％的升汞消毒20分钟(根据外植体成熟程度确定时间，越嫩的枝条或芽消毒时间越短)，消毒结束后，将茎段或茎尖剪成2cm左右的茎段待用；
2)无菌系建立：
将消毒后的茎段移入放有固体培养基的广口瓶中，无菌系建立用MS培养基，每瓶培养基数量为30ml，每瓶移入的蓝莓茎段或茎尖为10个，然后密封，再将培养瓶放进培养室培养。培养室温度控制在25℃(±1℃)，光照时间为12小时，光照强度为1000Lx。同时要控制好培养室周边的环境，避免外界对组培是的污染。对出现污染的茎段和培养基及时清理。
3)继代增殖：
通过60天培养保存，蓝莓的无菌系基本建成，此时可以进入继代培养过程。继代培养所用培养基为WPM培养基，所用激素为玉米素(ZT)，不另外使用其他激素，激素的浓度为2mg/升，每瓶接入无菌系的茎段2个，每瓶培养基为50ml，密封后放入培养室进行继代培养，培养室温度控制在25℃(±1℃)，每天光照12小时，关照强度1200Lx，每周对培养室进行1次消毒，20天更换1次培养基，通过一个周期的继代，每瓶的有效苗可达30苗以上。增殖系数可达15以上。
4)生根培养
继代结束的组培苗就进入生根培养阶段，生根培养采用瓶内生根方式，培养基采用WPM，激素使用IBA，浓度为0.5mg/L,生根培养的温度为25～28℃，光照时间每天12小时，光照强度1400Lx，通过25天的生根培养，95％的组培苗生根，生根率98％以上。
5)组培苗的过渡
将生根后的组培苗移入过渡大棚进行过渡，过渡用基质为草泥炭、腐殖土、膨胀珍珠岩和红土，其比例为3:1:1:1，基质的PH值调整为5.0，移植时，先将组培苗根上的培养基清洗干净，然后将其移栽在基质上，移植完后盖上小拱棚，保持棚内温度25℃，相对湿度85％，移植后的前5天每隔2h喷雾一次，以后每天喷雾2次，经过15d的过渡，其生根率可达85％以上，移栽成活率可达90％以上。
实施例3
一种蓝莓组培方法，包括以下步骤：
1)外植体处理：
选取当年生营养枝的幼嫩茎段或茎尖，在实验室内先剪去叶片，用蒸馏水将灰尘等清洗干净，将茎段或茎尖用75％的酒精消毒30秒，然后用0.15％的升汞消毒60分钟(根据外植体成熟程度确定时间，越嫩的枝条或芽消毒时间越短)，消毒结束后，将茎段或茎尖剪成2cm左右的茎段待用；
2)无菌系建立：
将消毒后的茎段移入放有固体培养基的广口瓶中，无菌系建立用MS培养基，每瓶培养基数量为40ml，每瓶移入的蓝莓茎段或茎尖为8个，然后密封，再将培养瓶放进培养室培养。培养室温度控制在25℃(±1℃)，光照时间为12小时，光照强度为1000Lx。同时要控制好培养室周边的环境，避免外界对组培是的污染。对出现污染的茎段和培养基及时清理。
3)继代增殖：
通过80天培养保存，蓝莓的无菌系基本建成，此时可以进入继代培养过程。继代培养所用培养基为WPM培养基，所用激素为玉米素(ZT)，不另外使用其他激素，激素的浓度为2mg/升，每瓶接入无菌系的茎段2个，每瓶培养基为50ml，密封后放入培养室进行继代培养，培养室温度控制在25℃(±1℃)，每天光照12小时，关照强度1200Lx，每周对培养室进行1次消毒，25天更换1次培养基，通过一个周期的继代，每瓶的有效苗可达30苗以上。增殖系数可达15以上。
4)生根培养
继代结束的组培苗就进入生根培养阶段，生根培养采用瓶内生根方式，培养基采用WPM，激素使用IBA，浓度为0.5mg/L,生根培养的温度为25～28℃，光照时间每天12小时，光照强度1400Lx，通过25～30天的生根培养，95％的组培苗生根，生根率98％以上。
5)组培苗的过渡
将生根后的组培苗移入过渡大棚进行过渡，过渡用基质为草泥炭、腐殖土、膨胀珍珠岩和红土，其比例为8:3:3:1，基质的PH值调整为5.5，移植时，先将组培苗根上的培养基清洗干净，然后将其移栽在基质上，移植完后盖上小拱棚，保持棚内温度28℃，相对湿度90％，移植后的前5天每隔2h喷雾一次，以后每天喷雾2次，经过20d的过渡，其生根率可达85％以上，移栽成活率可达90％以上。
该方法与其他方法相比，具有较为明显优势，一是繁殖系数较高，同等的材料可以获得更多的组培苗，二是单位成本明显下降，三是组培苗过渡成活容易，风险较小。从下面的表1和表2的实验对比数据就可以充分说明该方法的优势。
表1 不同培养基和激素浓度对蓝莓增殖的影响
表2 不同基质及环境条件对蓝莓过渡苗成活的影响
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。