本发明涉及一种通过组织培养的技术再生的方法，特别是涉及一种用于冰菜的通过组织培养的技术再生的方法。
背景技术：
随着生物科学的发展和世界耕地及林地等盐渍化程度的日益加重，引进耐盐品种和提高植物耐盐性的研究越来越受到重视，冰菜汁液中含有一定的盐分，在盐碱地改良、食用等方面具有较高的应用价值。
目前冰菜大规模生产中，培养基质中的含盐量不易控制，且采用常规的种子和茎段组织培养的方法进行培养，效果并不理想，或者是所得植株不够健壮，或者是长势不佳，培育出的冰菜口感也不好。
技术实现要素：
本发明是为了解决的以上技术问题，而提供的一种冰菜种子和茎段组织培养的方法，本发明的冰菜种子组织培养的方法出芽率高、长势好，本发明的冰菜茎段组织培养的方法得到的冰菜株高和鲜重均显著高于常规方法。本发明通过在培养基中加入盐溶液的培养方法，得到在较高含盐量(0.9％)的条件下生长良好的冰菜组培苗，并将其应用于耐盐生产。
本发明涉及一种冰菜种子组织培养的方法，所述方法包括以下步骤：
一、培养基的配制：调整MS培养基中蔗糖和琼脂的浓度，然后向MS培养基中加入NaCl，并调整pH值为5.8，得到冰菜培养基；
二、种子的处理：将冰菜种子放入三角瓶中，加入40mL水和2滴吐温80(表面活性剂)，充分震荡(5min)；然后用水冲洗冰菜种子5遍，沥干水；在超净工作台中，用75％的酒精浸泡振荡30s，用无菌水冲洗1次；用10％的次氯酸钠溶液浸泡振荡15min后，用无菌水冲洗4-5次；取出冰菜种子放入带有无菌滤纸的培养皿中，吸干水分；
三、接种、培养：取步骤二处理得到的冰菜种子置于步骤一制得的培养基上，培养温度为25～30℃；
其中，步骤一的冰菜培养基中蔗糖的质量分数为2％；琼脂的质量分数为0.75％；NaCl的质量分数为0.9～1％。
优选地，所述步骤三中，培养过程中冰菜种子出芽前为避光，出芽后光照强度为2000-3000Lx，光照周期12h/12h。
优选地，所述步骤三中，接种量为每瓶6粒冰菜种子。
本发明还涉及一种冰菜茎段组织培养的方法，所述方法包括以下步骤：
一、培养基的配制：调整MS培养基中蔗糖和琼脂的浓度，然后向MS培养基中加入NaCl，并调整pH值为5.8，得到冰菜培养基；
二、接种材料的制备：取冰菜种子接种于MS培养基中，培养42天，获得组培苗，从组培苗上切取长1～2cm的带叶片茎段，即为接种材料；
三、接种、培养：取步骤二得到的接种材料置于步骤一制得的培养基上，培养温度为25～30℃，光照强度为2000-3000Lx；
其中，步骤一的冰菜培养基中蔗糖的质量分数为2％；琼脂的质量分数为0.75％；NaCl的质量分数为0.9～1％。
优选地，所述步骤三中，光照周期12h/12h。
优选地，所述步骤三中，接种量为每瓶2个接种材料。
本发明的冰菜种子和茎段组织培养的方法与现有技术不同之处在于：
1.本发明的冰菜种子培养的方法出芽率高、长势好，本发明的冰菜茎段组织培养的方法得到的冰菜株高和鲜重均显著高于常规方法。本发明通过在培养基中加入盐溶液的培养方法，得到在较高含盐量(0.9％)的条件下生长良好的冰菜组培苗，并将其应用于耐盐生产
2.本发明的方法培养得到的冰菜带有大量冰晶，略带咸味；移栽后产量高。
3.本发明的方法简单，易操作掌握，效果显著，具有很好的应用前景。
具体实施方式
通过以下实施例和验证试验对本发明的冰菜种子和茎段组织培养的方法作进一步的说明。
实施例1
本实施例的冰菜种子组织培养的方法，所述方法包括以下步骤：
一、培养基的配制：调整MS培养基中蔗糖和琼脂的浓度，然后向MS培养基中加入NaCl，并调整pH值为5.8，得到冰菜培养基；
二、种子的处理：将冰菜种子放入三角瓶中，加入40mL水和2滴吐温80(表面活性剂)，充分震荡(5min)；然后用水冲洗冰菜种子5遍，沥干水；在超净工作台中，用75％的酒精浸泡振荡30s，用无菌水冲洗1次；用10％的次氯酸钠溶液浸泡振荡15min后，用无菌水冲洗4-5次；取出冰菜种子放入带有无菌滤纸的培养皿中，吸干水分；
三、接种、培养：取步骤二处理得到的冰菜种子置于步骤一制得的培养基上，接种量为每瓶6粒冰菜种子，培养温度为25℃，避光培养1天，冰菜种子出芽；然后调整光照强度为2000Lx，光照周期12h/12h，继续培养41天，得到大型冰晶状颗粒明显，生长健壮的冰菜组培苗；
其中，步骤一的冰菜培养基中蔗糖的质量分数为2％；琼脂的质量分数为0.75％；NaCl的质量分数为0.9％。
实施例2
本实施例的冰菜种子组织培养的方法，所述方法包括以下步骤：
一、培养基的配制：调整MS培养基中蔗糖和琼脂的浓度，然后向MS培养基中加入NaCl，并调整pH值为5.8，得到冰菜培养基；
二、种子的处理：将冰菜种子放入三角瓶中，加入40mL水和2滴吐温80(表面活性剂)，充分震荡(5min)；然后用水冲洗冰菜种子5遍，沥干水；在超净工作台中，用75％的酒精浸泡振荡30s，用无菌水冲洗1次；用10％的次氯酸钠溶液浸泡振荡15min后，用无菌水冲洗4-5次；取出冰菜种子放入带有无菌滤纸的培养皿中，吸干水分；
三、接种、培养：取步骤二处理得到的冰菜种子置于步骤一制得的培养基上，接种量为每瓶6粒冰菜种子，培养温度为28℃，避光培养1天，冰菜种子出芽；然后调整光照强度为3000Lx，光照周期12h/12h，继续培养41天，得到大型冰晶状颗粒明显，生长健壮的冰菜幼苗；
其中，步骤一的冰菜培养基中蔗糖的质量分数为2％；琼脂的质量分数为0.75％；NaCl的质量分数为1％。
实施例3
本实施例的冰菜种子组织培养的方法，所述方法包括以下步骤：
一、培养基的配制：调整MS培养基中蔗糖和琼脂的浓度，然后向MS培养基中加入NaCl，并调整pH值为5.8，得到冰菜培养基；
二、种子的处理：将冰菜种子放入三角瓶中，加入40mL水和2滴吐温80(表面活性剂)，充分震荡(5min)；然后用水冲洗冰菜种子5遍，沥干水；在超净工作台中，用75％的酒精浸泡振荡30s，用无菌水冲洗1次；用10％的次氯酸钠溶液浸泡振荡15min后，用无菌水冲洗4-5次；取出冰菜种子放入带有无菌滤纸的培养皿中，吸干水分；
三、接种、培养：取步骤二处理得到的冰菜种子置于步骤一制得的培养基上，接种量为每瓶6粒冰菜种子，培养温度为30℃，避光培养1天，冰菜种子出芽；然后调整光照强度为2500Lx，光照周期12h/12h，继续培养41天，得到大型冰晶状颗粒明显，生长健壮的冰菜组培苗；
其中，步骤一的冰菜培养基中蔗糖的质量分数为2％；琼脂的质量分数为0.75％；NaCl的质量分数为0.95％。
对实施例1-3中得到的冰菜幼苗进行测定，所得结果如表1所示。
接种7天后统计发芽率和死亡率，NaCl胁迫42d后，分别统计各个处理的株高(去掉根系从茎基部到生长点的长度)和鲜重(将植株去掉根系，称量鲜重)。
出芽率(％)＝出芽株数/接种株数×100％
成活率(％)＝成活株数/接种株数×100％
株高＝总高度/接种株数，取各瓶平均数
鲜重＝总的鲜重/接种株数，取各瓶平均数
表1实施例1-3中所得幼苗的出芽率、成活率、株高和鲜重
实施例4
本实施例的冰菜茎段组织培养的方法，所述方法包括以下步骤：
一、培养基的配制：调整MS培养基中蔗糖和琼脂的浓度，然后向MS培养基中加入NaCl，并调整pH值为5.8，得到冰菜培养基；
二、接种材料的制备：取冰菜组织接种于MS培养基中，培养42天，获得组培苗，从组培苗上切取长1～2cm的带叶片茎段，即为接种材料；
三、接种、培养：取步骤二得到的接种材料置于步骤一制得的培养基上，接种量为每瓶2个接种材料，培养温度为28℃，光照强度为2000Lx，光照周期12h/12h；培养42天，得到大型冰晶状颗粒明显，生长健壮的冰菜组培苗；
其中，步骤一的冰菜培养基中蔗糖的质量分数为2％；琼脂的质量分数为0.75％；NaCl的质量分数为0.9％。
实施例5
本实施例的冰菜茎段组织培养的方法，所述方法包括以下步骤：
一、培养基的配制：调整MS培养基中蔗糖和琼脂的浓度，然后向MS培养基中加入NaCl，并调整pH值为5.8，得到冰菜培养基；
二、接种材料的制备：取冰菜组织接种于MS培养基中，培养42天，获得组培苗，从组培苗上切取长1～2cm的带叶片茎段，即为接种材料；
三、接种、培养：取步骤二得到的接种材料置于步骤一制得的培养基上，接种量为每瓶2个接种材料，培养温度为30℃，光照强度为3000Lx，光照周期12h/12h；培养42天，得到大型冰晶状颗粒明显，生长健壮的冰菜组培苗；
其中，步骤一的冰菜培养基中蔗糖的质量分数为2％；琼脂的质量分数为0.75％；NaCl的质量分数为1％。
实施例6
本实施例的冰菜茎段组织培养的方法，所述方法包括以下步骤：
一、培养基的配制：调整MS培养基中蔗糖和琼脂的浓度，然后向MS培养基中加入NaCl，并调整pH值为5.8，得到冰菜培养基；
二、接种材料的制备：取冰菜种子接种于MS培养基中，培养42天，获得组培苗，从组培苗上切取长1～2cm的带叶片茎段，即为接种材料；
三、接种、培养：取步骤二得到的接种材料置于步骤一制得的培养基上，接种量为每瓶2个接种材料，培养温度为25℃，光照强度为2500Lx，光照周期12h/12h；培养42天，得到大型冰晶状颗粒明显，生长健壮的冰菜组培苗；
其中，步骤一的冰菜培养基中蔗糖的质量分数为2％；琼脂的质量分数为0.75％；NaCl的质量分数为0.95％。
对实施例1-3中得到的冰菜组培苗进行测定，所得结果如表1所示。
NaCl胁迫培养结束后，分别统计各个处理的株高(去掉根系从茎基部到生长点的长度)和鲜重(将植株去掉根系，称量鲜重)。
株高＝总高度/接种株数，取各瓶平均数
鲜重＝总的鲜重/接种株数，取各瓶平均数
表2实施例4-6中所得组培苗的株高和鲜重
验证试验1
分别将实施例1-3培养得到的冰菜幼苗和实施例4-6培养得到的冰菜组培苗在含0.9％盐营养液中进行水培，并结合冰菜生长发育的特性，控制温度、湿度、光照、pH值、EC值、盐浓度等各项影响因子，具体按以下步骤进行。
移栽：采用海绵作为栽培基质。
提前一天准备两块育苗专用十字海绵(如无十字，可用剪刀按6cm×6cm剪出十字)，进行清洗，即将海绵放到加水的无孔育苗盘，反复挤压后，更换新水，放置一夜，备用。
水培槽中加入营养液，水位离种植板约1cm的距离。半个小时后测电导度和pH值，调节Ec值为1200μs/cm左右，pH值在6.5-7.2之间(用硝酸和氢氧化钠调节pH值)。
第二天用镊子将组培苗插入海绵十字处，每十字处放1颗苗，带海绵栽到种植板上，种植板上开直径3cm的种植孔，孔距14cm，每孔栽一个苗，根系接触到清水。
栽植后管理：
营养液的管理：缓苗后开始添加盐溶液，盐浓度为0.6％-0.9％，调好定时器，白天每隔50min供液1次，每次供液10min。每天要巡视系统水位。在定植缓苗后每周补充水槽里蒸发掉的水份和营养液，约一个月补充一次Na的水溶液。根据水槽中水量加入粗盐或食盐使营养液中NaCl浓度约为0.9％。
环境条件控制：气温白天控制在20-30℃，夜间15-18℃。高温季节重点是遮阳、降温。冬春季节白天气温保持在17-22℃，夜温约15℃。营养液温度15-22℃；湿度控制在70％-90％；光强控制在3 000-15000lx。
分栽：待植物长满种植版，相互遮阴时分栽，隔一个种植孔取出一个苗，取出的苗移栽到新的育苗版上，增大植物的生长空间；及时摘掉病叶。
采收：定植30天后即可采收，在早晨温度较低时先轻轻地摘下植株下部的大叶片，再采收侧枝(要求嫩枝长15cm以上)，生长盛期每15d收获1次，分别码好放在包装盒或筐内。
结果：
在含有0.9％NaCl溶液中，以上实施例1-6中培育得到的冰菜幼苗和组培苗成活率高，冰菜生长旺盛，冰晶明显，口感好，产量高，具体数值如表3所示。
表3本发明培养得到幼苗移栽水培后的成活率和产量
通过以上验证试验可知，本发明方法培育得到的冰菜幼苗和冰菜组培苗在含盐(NaCl)量0.9％的水溶液中生长健壮、产量高，所得冰菜的冰晶明显、口感好；所述本发明培育得到的冰菜幼苗和冰菜组培苗耐盐性强。
验证试验2
不同NaCl浓度胁迫下冰菜种子的出芽率和成活率
设置不同的NaCl浓度：0.3％(T1)、0.6％(T2)、0.9％(T3)、1.2％(T4)；验证不同浓度的NaCl胁迫下冰菜种子的出芽率和成活率；其他参数与实施例1的方法相同。
冰菜种子用10％的次氯酸钠溶液表面消毒15分钟，效果很好，无污染，经观察，接种第二天25瓶都有种子出芽，出芽率50-70％不等。第一周无死亡现象，出芽率和成活率见表1。第二周以后开始出现生长不均衡现象，个别苗生长缓慢，甚至黄化死亡，存活下来的苗生长健壮，叶片肥大，茎粗壮。每瓶存活数越少，存活的苗子越健壮。全部苗都存活的瓶苗相对细弱，叶片小。
表4不同NaCl胁迫冰菜的发芽率和成活率
注：与对照的差＝处理-对照
由表1可以看出只有NaCl浓度为0.6％(T2)出芽率和成活率超过对照，达到最高，其它处理均低于对照，NaCl浓度为1.2％(T4)出芽率最低；NaCl浓度为0.9％(T3)成活率与对照持平，而Nacl浓度为0.3％(T1)成活率最低。但成活下来的苗生长健壮。冰菜可以在NaCl浓度为0-1.2％范围内生长，但达到1.2％时出芽率和成活率开始下降。
验证试验3
不同NaCl浓度胁迫下冰菜种子培养组胚苗的株高和鲜重
设置不同的NaCl浓度：0.3％(T1)、0.6％(T2)、0.9％(T3)、1.2％(T4)；验证不同浓度的NaCl胁迫下组培苗的株高和鲜重；其他参数与实施例1的方法相同。
表5不同NaCl胁迫冰菜的株高和鲜重
注：与对照的差＝(处理-对照)/对照×100％
接种后第一周，对照植株最高，NaCl浓度越高，植株越矮。第一周株高Nacl浓度为1.2％(T4)与对照相差高达63.6％。经观察子叶全部展开，但NaCl浓度越高，子叶越小。以后差异变小。至第六周，Nacl浓度为0.3％(T1)株高和鲜重最大，原因是T1瓶苗成活率低，生长空间大，生长健壮，单株株高和重量大。株高除T4外其它处理均高于对照，最高T1高出对照13.6％，T4株高和鲜重最小，较对照低27.1％。各处理单株鲜重均高于对照，T1最大，高于对照57.6％，其次T3高于对照52.9％。T4与对照差异最小，高于对照7.9％。
验证试验4
不同NaCl浓度胁迫下冰菜茎段培养组培苗的株高和鲜重
设置不同的NaCl浓度：0.3％(T1)、0.6％(T2)、0.9％(T3)、1.2％(T4)；验证不同浓度的NaCl胁迫下冰菜茎段培养组培苗的株高和鲜重；其他参数与实施例4的方法相同。
表6 NaCl胁迫对冰菜株高和鲜重的影响
注：与对照的差＝(处理-对照)/对照×100％
茎段培养成活率均为100％，培养6周后，各处理株高和单株鲜重均高于对照，Nacl浓度为0.9％(T3)瓶苗株高和单株鲜重均最大，株高高出对照46.9％，单株鲜重高出对照90.8％。T1与对照相差最小，株高为4.9％，鲜重为0.7％。T2和T4与对照相差较小，株高分别为33.3％和46.9％；单株鲜重分别为27.7％和26.1％。
经观察，T3的瓶苗冰晶最明显，生长健壮。所有处理的瓶苗株高和单株鲜重均比对照大，生长健壮。说明冰菜不仅耐盐，而且在培养基中适度添加Nacl溶液，有利于生长。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。