一种烟草八倍体纯合植株的快速培养方法与流程

本发明属于烟草育种技术领域，涉及一种烟草八倍体纯合植株的快速培养方法。

背景技术：

倍性育种是目前植物育种的重要方向之一。相比于普通二倍体材料，多倍体在外观形态、有效成分含量、对逆境的适应能力方面都具有一定的优势。部分多倍体由于具有单性结实的能力而被广泛应用于农业生产。

烟草为我国部分地区的支柱产业，也是部分农村赖以致富的主要作物，对国民经济的影响巨大。烟草育种主要采用不同品种间的杂交以及多代回交或自交。由于育种方式的限制以及资源的匮乏，使得烟草育种面临巨大的瓶颈。新的育种方法的应用将一方面有助于烟草种质资源的拓展，另一方面对烟草育种实践提供重要的参考。

烟草生产中主要采用的品种均为四倍体烟草品种，这主要是因为烟草为异源四倍体物种，即染色体组成为2n＝4x＝sstt＝48。未见其它材料用于生产的报道，在育种研究中也较少提及。为拓展育种资源，创制其它倍性材料是极为必要的。其它倍性材料的获得可通过花药培养、小孢子培养获得单倍体，染色体加倍获得多倍体，不同倍性间杂交获得多倍体和非整倍体。可见染色体加倍在其它倍性材料的获得中占有非常重要的位置。

目前获得植物染色体加倍植株的方法有多种，如：低温处理、高温处理、化学试剂处理、射线处理等，其中以化学试剂处理最为常见。化学试剂处理中以秋水仙素应用最为广泛。利用秋水仙素进行处理方法也有多种，如：处理种子、处理茎尖、处理组培苗等，前两种方法虽然简易，但是所获得多为嵌合体，后一种方法虽可获得纯合多倍体，但需预先建立无菌培养体系，较为费时。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种烟草八倍体纯合植株的快速培养方法，解决了现有技术中存在的问题，操作简易，且时间较短。

本发明所采用的技术方案是：一种烟草八倍体纯合植株的快速培养方法，将烟草幼苗或烟草植株茎尖经秋水仙素活体诱导染色体加倍，取变异植株或变异叶片进行组织培养，对再生植株进行检测，获得八倍体植株。

本发明所采用的另一技术方案是：一种烟草八倍体纯合植株的快速培养方法，具体按照以下步骤进行：

种子处理：

步骤1，取四倍体烟草种子若干，于30℃温水中浸泡过夜8-10h后捞出，于25℃保湿黑暗催芽，以提高种子萌发率和萌发整齐度；

步骤2，待种子露白后，用0.2％秋水仙素溶液浸泡48h进行诱导，使染色体加倍；此时胚处于快速生长期，有利于八倍体诱导；

步骤3，去除秋水仙素溶液，露白种子于蒸馏水中漂洗3次，并浸泡2次，每次2h，以清除种子内残留的秋水仙素；

步骤4，清洗后的种子于25℃光照下培养3-5d，待子叶打开，生长成苗；

以上1-4步为染色体加倍诱导。

步骤5，待子叶完全打开后，选取生长缓、矮壮的变异植株为材料；

步骤6，将选取的植株去除种壳后，包于一层纱布中，用细线扎纱布开口处，于0.1％的hgcl2溶液中进行表面灭菌，无菌水清洗3次后接种于诱导增殖培养基ms+1.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa上；

步骤7，40d后，待不定芽生长至3-5cm，切取不定芽于生根培养基1/2ms+2.0mg/liba中，7-10d后即可生根；

以上5-7步为组织培养。

步骤8，倍性鉴定及移栽：切取根尖用流式细胞仪进行倍性鉴定，并采用去壁低渗火焰干燥法进行染色体制片进行确认后移栽，即可筛选获得八倍体植株。

本发明所采用的另一技术方案是：一种烟草八倍体纯合植株的快速培养方法，具体按照以下步骤进行：

茎尖处理：

步骤1，将快速生长的烟草植株茎尖附近展开和即将展开的叶片摘去，确保秋水仙素溶液能浸入茎尖快速生长部分；用棉花浸蘸0.2％秋水仙素包裹茎尖5d，塑料袋包裹棉花保湿；

步骤2，处理5d后去除棉花，待茎尖自由生长，7d后，茎尖叶片展开；

以上1-2步为染色体加倍诱导。

步骤3，取经诱导处理并继续生长的植株茎尖部位发生形态变化的叶片，进行表面灭菌；将叶片包于一层纱布中，用细线扎纱布开口处，于0.1％的hgcl2溶液中进行表面灭菌，无菌水清洗3次后接种于诱导增殖培养基ms+1.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa上；

步骤4，40d后，待不定芽生长至3-5cm，切取不定芽于生根培养基1/2ms+2.0mg/liba中，7-10d后即可生根；

以上3-4步为组织培养。

步骤5，倍性鉴定及移栽：切取根尖用流式细胞仪进行倍性鉴定，并采用去壁低渗火焰干燥法进行染色体制片进行确认后移栽，即可筛选获得八倍体植株。

本发明的有益效果是将处理后的种子萌发成苗后，选形态发生变异的幼苗进行组织培养，保证了诱导的成功率；处理后的茎尖生长一段时间后，取形态变异的组织进行组织培养，同样保证了诱导的成功率；由于材料处理并发生变异后进行组织培养，在组织培养条件下，再生植株多为单细胞起源。因此，再生植株均为纯合的植株。

附图说明

图1是k326八倍体(2n＝8x＝96)植株染色体(dapi染色)图。

图2a：k326四倍体流式细胞仪检测结果；图2b：k326八倍体流式细胞仪检测结果；图2c：k326四倍体和八倍体混合样品流式细胞仪检测结果。

图3是云烟87八倍体(2n＝8x＝96)植株染色体(dapi染色)图。

图4a：云烟87四倍体流式细胞仪检测结果；图4b：云烟87八倍体流式细胞仪检测结果；图4c：云烟87四倍体和八倍体混合样品流式细胞仪检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

一种烟草八倍体纯合植株的快速培养方法，首先将烟草幼苗或烟草植株茎尖经秋水仙素活体诱导染色体加倍，取变异植株或变异叶片进行组织培养，对再生植株进行检测，获得纯合八倍体植株。具体来说，包括：染色体加倍诱导、组织培养、倍性鉴定及移栽三大步骤。

本文中，采用先染色体加倍诱导再组织培养的方法，一方面保障了材料受伤害的程度提高存活率。另一方面减少预先建立组培体系，与传统对组培苗进行诱导的方法而言，节约了时间。

本方法与传统方法相比所具有的优势：

与传统浸泡组培苗的方法相比，本方法取已经诱导并发生形态变异的幼小植株和经诱导后发生变异的田间植株的叶片。这相当于对诱导后的材料进行了初选，提高了加倍植株筛选的成功率。

与传统浸泡组培苗的方法相比，本方法不用预先建立组织培养快繁体系，短期内(2个月)即可获得八倍体植株。

与田间茎尖浸泡法相比，本方法通过对形态变异的有效植株和叶片进行组织培养，由于组织培养条件下的再生植株多为单细胞起源，所获得的染色体加倍植株多为纯合体植株。

本发明的重点为种子露白后经秋水仙素诱导后再经组织培养成苗。

实施例1

k326八倍体诱导

种子处理：

(1)取当年的(萌发率较高，整齐度也较高)k326种子烟草种子若干，于温水(30℃)中浸泡过夜(8-10h)后捞出，于25℃保湿黑暗催芽，以提高种子萌发率和萌发整齐度。

(2)待种子露白后，用0.2％秋水仙素溶液浸泡48h进行诱导，使染色体加倍；此时胚处于快速生长期，有利于八倍体诱导。

(3)去除秋水仙素溶液，露白种子于蒸馏水中漂洗3次，并浸泡2次，每次2h，以清除种子内残留的秋水仙素；

(4)清洗后的种子于25℃光照下培养3-5d，待子叶打开，生长成苗；

(5)待子叶完全打开后，选取生长缓、矮壮的变异植株为材料；

(6)将选取的植株去除种壳后，包于一层纱布中，用细线扎纱布开口处，于0.1％的hgcl2溶液中进行表面灭菌，无菌水清洗3次后接种于诱导增殖培养基(ms+1.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa)上；

(7)40d后，待不定芽生长至3-5cm，切取不定芽于生根培养基(1/2ms+2.0mg/liba)中，7-10d后即可生根；

以上5-7步为组织培养。

(8)倍性鉴定及移栽：切取根尖用流式细胞仪进行倍性鉴定，并采用去壁低渗火焰干燥法进行染色体制片进行确认后移栽，即可筛选获得八倍体植株。

实施例2

茎尖处理：

(1)将快速生长的烟草植株茎尖附近展开和即将展开的叶片摘去，确保秋水仙素溶液能浸入茎尖快速生长部分；用棉花浸蘸0.2％秋水仙素包裹茎尖5d，塑料袋包裹棉花保湿；

(2)处理5d后去除棉花，待茎尖自由生长，7d后，茎尖叶片展开；

(3)取经诱导处理并继续生长的植株茎尖部位发生形态变化的叶片，进行表面灭菌；将叶片包于一层纱布中，用细线扎纱布开口处，于0.1％的升汞水溶液中进行表面灭菌，无菌水清洗3次后接种于诱导增殖培养基(ms+1.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa)上；

(4)40d后，待不定芽生长至3-5cm，切取不定芽于生根培养基(1/2ms+2.0mg/liba)中，7-10d后即可生根；

(5)倍性鉴定及移栽：切取根尖用流式细胞仪进行倍性鉴定，并采用去壁低渗火焰干燥法进行染色体制片进行确认后移栽，即可筛选获得八倍体植株。在本实例中，所获得的植株八倍体比例达86％(50株中检测出43株)，且经流式细胞仪检测全部为纯合体植株。

图1k326八倍体(2n＝8x＝96)植株染色体(dapi染色)。

图2k326八倍体植株的流式细胞仪检测结果(图2a：k326四倍体流式细胞仪检测结果；图2b：k326八倍体流式细胞仪检测结果；图2c：k326四倍体和八倍体混合样品流式细胞仪检测结果。)结果显示：所获得的八倍体为纯合植株。

实施例3

云烟87八倍体诱导

种子处理：

(1)取当年的(萌发率较高，整齐度也较高)云烟87种子烟草种子若干，于温水(30℃)中浸泡过夜(8-10h)后捞出，于25℃保湿黑暗催芽，以提高种子萌发率和萌发整齐度。

(2)待种子露白后，用0.2％秋水仙素溶液浸泡48h进行诱导，使染色体加倍；此时胚处于快速生长期，有利于八倍体诱导。

(3)去除秋水仙素溶液，露白种子于蒸馏水中漂洗3次，并浸泡2次，每次2h，以清除种子内残留的秋水仙素；

(4)清洗后的种子于25℃光照下培养3-5d，待子叶打开，生长成苗；

(5)待子叶完全打开后，选取生长缓、矮壮的变异植株为材料；

(6)将选取的植株去除种壳后，包于一层纱布中，用细线扎纱布开口处，于0.1％的hgcl2溶液中进行表面灭菌，无菌水清洗3次后接种于诱导增殖培养基(ms+1.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa)上；

(7)40d后，待不定芽生长至3-5cm，切取不定芽于生根培养基(1/2ms+2.0mg/liba)中，7-10d后即可生根；

(8)倍性鉴定及移栽：切取根尖用流式细胞仪进行倍性鉴定，并采用去壁低渗火焰干燥法进行染色体制片进行确认后移栽，即可筛选获得八倍体植株。

实施例4

茎尖处理：

(1)将快速生长的烟草植株茎尖附近展开和即将展开的叶片摘去，确保秋水仙素溶液能浸入茎尖快速生长部分；用棉花浸蘸0.2％秋水仙素包裹茎尖5d，塑料袋包裹棉花保湿；

(2)处理5d后去除棉花，待茎尖自由生长，7d后，茎尖叶片展开；

(3)取经诱导处理并继续生长的植株茎尖部位发生形态变化的叶片，进行表面灭菌；将叶片包于一层纱布中，用细线扎纱布开口处，于0.1％的升汞水溶液中进行表面灭菌，无菌水清洗3次后接种于诱导增殖培养基(ms+1.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa)上；

(4)40d后，待不定芽生长至3-5cm，切取不定芽于生根培养基(1/2ms+2.0mg/liba)中，7-10d后即可生根；

(5)倍性鉴定及移栽：切取根尖用流式细胞仪进行倍性鉴定，并采用去壁低渗火焰干燥法进行染色体制片进行确认后移栽，即可筛选获得八倍体植株。在本实例中，所获得的植株八倍体比例达86％(50株中检测出43株)，且经流式细胞仪检测全部为纯合体植株。

图3云烟87八倍体(2n＝8x＝96)植株染色体(dapi染色)。

图4云烟87八倍体植株的流式细胞仪检测结果(图4a：云烟87四倍体流式细胞仪检测结果；图4b：云烟87八倍体流式细胞仪检测结果；图4c：云烟87四倍体和八倍体混合样品流式细胞仪检测结果。)结果显示：所获得的八倍体为纯合植株。