烟草黑胫病菌生理小种的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种烟草黑腔病菌生理小种的鉴定方法，属于植物病原鉴定技术领 域。
【背景技术】
[0002] 烟草黑腔病是一种世界性的毁灭性±传卵菌病害。20世纪80年代后期，随着我国 烟草种植面积的不断扩大，烟草黑腔病迅速扩展。由于不同烟草黑腔病菌生理小种在致病 力方面表现差异，因此需要对烟田中黑腔病菌生理小种进行密切监测。截止到目前为止，国 际上已报道的烟草黑腔病菌生理小种有5种，其中美国报道的有4种，即0、1、3和4号小种，非 洲报道的有1种，即2号小种，而我国仅发现0号和1号小种。
[0003] 公开号CN101671720A的发明专利公开了一种病圃中烟草黑腔病菌生理小种的鉴 定方法，步骤如下：（1)测定鉴别寄主在田间的抗病反应:在病圃中栽培鉴别寄主，烤烟烟叶 采收后挖根调查，按国家标准对鉴定品种进行分级和抗性评价，结合烟草黑腔病菌0、1、2和 3号小种的寄主反应判断生理小种类型；（2)测定菌株在TTC固体培养基中的颜色变化:从病 圃中随机采集不同品种的病株，分离纯化病原并鉴定，再进行TTC法测定，根据颜色变化判 断黑腔病菌生理小种类型；（3)结合步骤（1)、（2)的鉴定结果，判断生理小种类型；步骤（1) 中鉴别寄主在田间的抗病反应在云南省烟草科学研究所研和试验基地进行，利用有病连作 烟田作病圃，诱其自然发病，于06~08年在自然病圃中种植N.plumbaginifolia、NC1071、 L8、N.nudicaulis、红大(CK)、K326(CK)、潘圆黄、Bレ921、CV78-5等品种，小区随机排列，S 次重复，每品种每重复种植一行，每行35株;栽培管理常规漂浮育苗、适龄移栽，烟苗成活后 田间多诱水，保证田间湿度，施肥按常规管理。该方法虽能对烟草黑腔病菌的生理小种作出 初步鉴定，但由于大田栽培受环境因素影响较大，试验结果的准确性仍有待考证。一般的， 烟草黑腔病菌生理小种的鉴定在溫室条件下通过根源接种进行，但是该方法需要配备溫室 设施，且菌株接种至少需要7~8周龄的烟草幼苗(幼苗在接种前需移植），操作费时费力。因 此有必要建立一种能稳定、快速鉴定烟草黑腔病菌生理小种的方法，从而最大限度地节约 人力和物力。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种能稳定、快速鉴定烟草黑腔病菌生理小种的方法。
[0005] 为了实现W上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0006] 烟草黑腔病菌生理小种的鉴定方法，包括W下步骤：
[0007] (1)不同鉴别寄主对各个烟草黑腔病菌生理小种的抗病反应
[000引无菌条件下，将经消毒处理的不同鉴别寄主的种子分别接种到组培瓶中无菌培养 基上，每个组培瓶接种一粒，培养至鉴别寄主幼苗长出5~6片真叶;将烟草黑腔病菌不同生 理小种的菌丝分别接种到生长有鉴别寄主幼苗的培养基上，每个组培瓶接种一种生理小 种，共培养2~3周，感病对照和抗病对照同上操作，统计不同鉴别寄主对烟草黑腔病菌各生 理小种的抗病反应；
[0009] (2)感染样品中烟草黑腔病菌生理小种的判定
[0010] 从感染样品中分离、纯化出病原菌，将初步鉴定为烟草黑腔病菌的病原菌菌丝接 种到生长有鉴别寄主幼苗的培养基上，统计不同鉴别寄主对病原菌的抗病反应，对比步骤 (1)中统计结果，判定病原菌的生理小种类型。
[0011] 步骤(1)中所述消毒处理的方法为:将经浸种处理的种子依次置于乙醇、次氯酸钢 溶液中消毒，无菌水洗净后再接种到培养基上。其中，浸种处理为本领域常规操作，如在无 菌水中浸泡3~5天；消毒处理中乙醇的浓度可为65~75%，时间20~40s，次氯酸钢溶液的 浓度可为5~15%，时间10~20min;无菌水洗涂3~5次即可清除残留于种子表面的次氯酸 钢。
[0012] 步骤(1)中所述鉴别寄主的筛选方法可参照文献(苗圃，王海涛，李淑君等.河南省 烟草黑腔病菌生理小种鉴定，西北农业学报，2013,22(10) :204-220)中记载。优选的，鉴别 寄主的品种为L8、NC1071、Florida301和小黄金1025,鉴别寄主对烟草黑腔病菌各生理小种 的抗病反应见下表1。
[0013] 步骤（1)中所述培养基为可供烟草种子萌发及幼苗生长的培养基，一般情况下也 满足烟草黑腔病菌不同生理小种的生长需要。例如可选用MS培养基、B5培养基等。
[0014] 步骤（1)中所述培养的条件优选为:溫度24~32°C，湿度50~70%，光照强度2500 ~3500LX，光周期14~1她/d,时间35~45d。更优为:溫度26~30°C，湿度50~70%，光照强 度3000LX，光周期16h/d，时间40d。
[0015] 步骤(1)中所述菌丝为新鲜培养的烟草黑腔病菌生理小种的菌丝，可适量接种，如 0.8~1.2mg。接种可参照W下步骤操作:在均匀长满烟草黑腔病菌菌丝的培养平板上，利用 打孔器在距离平板中屯、等距的位置打孔，获取直径为0.5cm的带菌丝的培养基碟片，将其投 入到生长有鉴别寄主幼苗的组培瓶中即可。
[0016] 步骤(1)中所述感病对照的品种可选用红大，抗病对照的品种可选用K326。
[0017] 步骤（1)中所述统计抗病反应的方法为本领域常规技术，可参照已公开专利文献 (公开号CN101671720A)中方法，病害分级标准、抗性评价标准也与之相同。
[0018] 步骤(2)中所述病原菌的分离、纯化方法为本领域常规技术，可参照W下步骤操 作:将疑似感染烟草黑腔病菌的烟株洗净后惊干，用灭菌刀将茎杆剖开，从碟片状的病键交 界处取髓部组织(大小约3mmX3mm)，依次用10%次氯酸钢、75%乙醇进行表面消毒处理，无 菌水漂洗后用无菌滤纸吸干水分，接种到燕麦琼脂培养基上，于28°C恒溫箱中培养2~3d， 根据烟草黑腔病菌典型特征(如菌落形态、颜色、菌丝形态等)挑取边缘菌落，接种到新的燕 麦琼脂培养基上，于28 °C恒溫箱中进行纯化培养。
[0019] 步骤(2)中所述初步鉴定为将病原菌的菌落形态、菌丝形态、抱子囊形态、游动抱 子形态等与烟草黑腔病菌的典型特征进行比对，判定其是否具有烟草黑腔病菌的典型特 征，如果有则初步鉴定为烟草黑腔病菌，反之则否;初步鉴定方法为本领域常规技术。具体 可参照W下步骤进行:将纯化的病原菌接种到燕麦琼脂培养基上，于28°C恒溫箱中暗培养 7d，观察菌落形态和菌丝形态;继续培养20~25天，采用水中产抱法将生长旺盛的烟草黑腔 病菌于28°C恒溫箱中暗培养4她，诱导产生抱子囊，在显微镜下观察病原菌的抱子囊形态； 再将含抱子囊的悬浮液置于4°C冰箱中15~30min，取出于室溫下放置片刻，在显微镜下观 察病原菌的游动抱子形态;结合病原菌菌落形态、菌丝形态、抱子囊形态和游动抱子形态作 出初步鉴定。
[0020] 步骤(2)中所述菌丝接种方法同上。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 相较大田鉴定法和溫室鉴定法，本发明中组培瓶法鉴定烟草黑腔病菌生理小种更 加快速，鉴定结果更加准确、稳定和可靠。
[0023] 本发明中组培瓶鉴定法的环境条件稳定，有利于加速烟草、病原菌的生长，大幅缩 短育苗周期和浸染周期（普通大田鉴定需要至少90天，组培鉴定大约50天），同时还能避免 杂菌及其他生理小种对鉴定结果产生干扰，通量高，能最大限度地节约人力和物力，从而实 现对烟草黑腔病菌生理小种的高通量、快速、准确鉴定，该方法经济实用，具有较高的应用 价值，能够为烟草其他病害病原菌的生理小种鉴定提供一种思路。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例1中菌株NX3的菌落形态图；
[0025] 图2为菌株NX3的菌丝形态图；
[00%]图3为各鉴别寄主接种黑腔病菌LS2菌丝前后的生长状况图。
【具体实施方式】
[0027] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0028] 实施例1
[0029] 本实施例中烟草黑腔病菌生理小种的鉴定方法，包括W下步骤：
[0030] (1)不同鉴别寄主对各个烟草黑腔病菌生理小种的抗病反应
[0031] a.分别将鉴别寄主（即烟草品种L8、NC1071、Florida301和小黄金1025)的种子在 无菌水中浸泡1〇化，吸干表面水分后自然惊干;将浸种回干的种子用浓度70%的乙醇消毒 30s，再用浓度10%的次氯酸钢消毒15min，最后用无菌水洗涂4次，清除残留于种子表面的 次氯酸钢；
[0032] b.无菌条件下，将经消毒处理的鉴别寄主种子分别接种到盛装有MS培养基的组培 瓶中，每个组培瓶接种一粒(每个烟草品种设4个重复，每个重复10个组培瓶），组培瓶口用 0.22WI1滤膜封口，置于溫度28°C、湿度60 %、光照强度3000LX、光周期16h/d条件下培养40d;
[0033] C.采用燕麦琼脂培养基培养烟草黑腔病菌不同生理小种，在均匀长满烟草黑腔病 菌0号小种菌丝的IOcm平板上，用打孔器在距离平板中屯、5cm的位置打孔，得到3个直径 0.5cm带菌丝的培养基碟片(每个碟片上菌丝重Img)，并将其投入到上述生长有鉴别寄主幼 苗的组培瓶中，与鉴别寄主幼苗共培养2周，共培养的条件同上，其他生理小种1号、2号、3号 同上操作；
[0034] 感病对照红大和抗病对照K326浸染操作同步骤a、b、c;
[0035] 燕麦琼脂培养基为:30g燕麦片加 1000 mL水，煮沸化，用纱布过滤后补水至1000血， 加琼脂粉llg(l〇~1?均可），溶解后分装灭菌；
[0036] d.按照烟草黑腔病分级标准逐株记录各烟株的病级数，并计算不同生理小种浸染 后鉴别寄主的病情指数，统计不同鉴别寄主对各个烟草黑腔病菌生理小种的抗病反应，结 果见下表1;
[0037]烟草黑腔病病害分级标准如下：
[003引 0级:全株无病；
[0039] 1级:茎部病斑不超过茎围的1/3,或1/3W下叶片调萎；
[0040] 3级:茎部病斑环绕茎围1/3~1/2,或1/3~1/2叶片轻度调萎，或下部少数叶片出 现病斑；
[0041 ] 5级:茎部病斑超过茎围的1/2，但未全部环绕茎围，或1/2~2/3叶片调萎；
[0042] 7级:茎部病斑全部环绕茎围，或2/3W上叶片调萎；
[0043] 9级:病株基本枯死；
[0044] 病情指数计算公式如下：
[0045] 病指=X (各级病株数X该病级值)/(调查总株数X最高级值）X 100;
[0046] 抗性评价标准：
[0047] 高抗:病情指数0~5,用HR表示；
[004引抗:病情指数5. Ol~25,用R表示；
[0049] 中抗:病情指数25. Ol~50，用MR表示；
[0050] 中感:病情指数50.0 l~75，用MS表示；
[0051] 感:病情指数75W上，用S表示。
[0052] 表1不同鉴别寄主对各个烟草黑腔病菌生理小种的抗病反应 [0化3]
[0054] (2)感病烟株中烟草黑腔病菌生理小种的判定
[0055] 从河南省多个县区（包括S 口峡陕县、南阳内乡、南阳浙川、S 口峡灵宝、S 口峡卢 氏、周口鹿邑、洛阳汝阳、洛阳洛宁等)采集疑似感染烟草黑腔病菌的烟株28份，自来水洗净 惊干后用灭菌刀将烟株的茎杆剖开，从碟片状的病键交界处取大小3mm X 3mm的髓部组织， 依次用10%次氯酸钢消毒Imin,75%乙醇消毒Imin,再用无菌水漂洗2次，将漂洗过的组织 用无菌滤纸吸干水分，再接种到燕麦琼脂培养基上，做好标记，置于28°C恒溫箱中培养3d， 根据烟草黑腔病菌典型特征(如菌落形态、颜色、菌丝形态等)挑取边缘菌落，接种到新的燕 麦琼脂培养基上，于28 °C恒溫箱中纯化培养7d;
[0056] 将纯化的病原菌接种到燕麦琼脂培养基上，于28°C恒溫箱中暗培养7d，观察菌落 形态和菌丝形态;继续培养21天，采用水中产抱法将生长旺盛的烟草黑腔病菌于28°C恒溫 箱中暗培养4她，诱导产生抱子囊，在显微镜下观察病原菌的抱子囊形态;再将含抱子囊的 悬浮液置于4°C冰箱中25min，取出于室溫下放置3min，在显微镜下观察病原菌的游动抱子 形态;结合病原菌菌落形态、菌丝形态、抱子囊形态和游动抱子形态特征，初步鉴定有28份 感病烟株均感染烟草黑腔病菌(菌株NX3的菌落形态见图1，菌丝形态见图2);
[0057] 将初步鉴定为烟草黑腔病菌的菌丝接种到生长有鉴别寄主幼苗的组培瓶中，共培 养16d(共培养条件同上），其中鉴别寄主幼苗培养同步骤（1)中a、b操作，菌丝接种同步骤 (1)中C操作；图3为各鉴别寄主接种黑腔病菌LS2菌丝前后的生长状况图，图中A、B为小黄金 1025接种前后的生长状况，C、D为L8接种前后的生长状况，E、F为NC1071接种前后的生长状 况，G、H为Florida301接种前后的生长状况；
[0058] 按照烟草黑腔病分级标准逐株记录各烟株的病级数，并计算烟草黑腔病菌浸染后 鉴别寄主的病情指数，统计不同鉴别寄主对从各感病烟株中分离得到的烟草黑腔病菌的抗 病反应，对照表1中分类结果，判定感病烟株中烟草黑腔病菌的生理小种类型，结果见下表 2。
[0059] 表2不同鉴别寄主对从各感病烟株中分离得到的烟草黑腔病菌的抗病反应 [00601
【主权项】
1. 烟草黑胫病菌生理小种的鉴定方法，其特征在于:包括以下步骤： (1) 不同鉴别寄主对各个烟草黑胫病菌生理小种的抗病反应 无菌条件下，将经消毒处理的不同鉴别寄主的种子分别接种到组培瓶中无菌培养基 上，每个组培瓶接种一粒，培养至鉴别寄主幼苗长出5~6片真叶;将烟草黑胫病菌不同生理 小种的菌丝分别接种到生长有鉴别寄主幼苗的培养基上，每个组培瓶接种一种生理小种， 共培养2~3周，感病对照和抗病对照同上操作，统计不同鉴别寄主对烟草黑胫病菌各生理 小种的抗病反应； (2) 感染样品中烟草黑胫病菌生理小种的判定 从感染样品中分离、纯化出病原菌，将初步鉴定为烟草黑胫病菌的病原菌菌丝接种到 生长有鉴别寄主幼苗的培养基上，统计不同鉴别寄主对病原菌的抗病反应，对比步骤(1)中 统计结果，判定病原菌的生理小种类型。2. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于:步骤(1)中所述消毒处理的方法为:将 经浸种处理的种子依次置于乙醇、次氯酸钠溶液中消毒，无菌水洗净后再接种到培养基上。3. 根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于：消毒处理中乙醇的浓度为65~75%， 时间20~40s;次氯酸钠溶液的浓度为5~15%，时间10~20min。4. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于:步骤（1)中所述鉴别寄主的品种为L8、 NC1071、Florida301 和小黄金 1025。5. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于:步骤（1)中所述培养基为MS培养基、B5 培养基中任一种。6. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于:步骤（1)中所述培养的条件为:温度24 ~32°C，湿度50~70%，光照强度2500~3500Lx，光周期14~18h/d，时间35~45d。7. 根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于:培养的条件为:温度26~30 °C，湿度50 ~70%，光照强度3000Lx，光周期16h/d，时间40d。8. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于:步骤（1)中所述菌丝的接种量为0.8~ 1.2mg新鲜菌丝。9. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于:步骤（1)中所述感病对照的品种为红 大，抗病对照的品种为K326。
【专利摘要】本发明公开了一种烟草黑胫病菌生理小种的鉴定方法，属于植物病原鉴定技术领域。本发明采用组培瓶法鉴定烟草黑胫病菌生理小种，培育、浸染的环境条件更加稳定，有利于加速烟草、病原菌的生长，大幅缩短育苗周期和浸染周期，同时还可避免杂菌及其他生理小种对鉴定结果产生干扰，且通量高，能最大限度地节约人力、物力，实现对烟草黑胫病菌生理小种的高通量、快速、准确鉴定。相较大田法和温室法，鉴定快速，结果更加准确、稳定和可靠，具有较高的应用价值。同时也能为烟草其他病害病原菌的生理小种鉴定提供一种思路。
【IPC分类】C12Q1/04
【公开号】CN105713953
【申请号】CN201511018224
【发明人】胡利伟, 马聪, 范艺宽, 徐敏, 刘芳, 奚家勤, 尹启生, 宋纪真, 薛超群, 刘阳, 牟文君, 郭建华
【申请人】中国烟草总公司郑州烟草研究院, 中国烟草总公司河南省公司