一种拟南芥管状分子体外诱导培养的方法与流程

本发明涉及一种拟南芥管状分子体外诱导培养的方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术：

生物质能源的开发是应对能源危机的有效途径。细胞壁成分是地球上产量最高的生物质，细胞壁的主要成分有纤维素、半纤维素和木质素，其中木质素严重阻碍纤维素和半纤维素的有效利用，因此，对细胞壁形成的机理研究和成分改造有利于生物质能源的高效利用。

管状分子是植物木质部组织的主要功能结构——包括管胞和导管，负责根吸收的水分向地上部分长距离的运输。管状分子侧壁的纹状加厚是管状分子的主要结构特征，这一结构为导管长距离的运输功能提供重要机械支持作用。管状分子是由根尖分生组织产生的导管前体细胞分化而来的，其细胞分化过程由细胞纵向伸长、次生壁纹状加厚和穿孔板形成3个连续阶段组成。次生壁在管状分子侧壁有规律的纹状加厚受到胞内机制的精密控制，次生壁物质的沉积只发生在侧壁而不能发生在两端(穿孔板部位)，次生壁在侧壁上不是均匀累积而是呈规则的纹状加厚，管状分子的这一加厚模式称之为次生壁物质的极性沉积。因此管状分子是研究次生壁物质累积的一个良好模型。

由于管状分子位于植物体内部，且处于正在发育过程中的管状分子相对数量较少，对发育中的管状分子进行研究取材极为困难，因此对管状分子进行体外诱导培养成为次生壁成分累积研究的一个重要手段。但目前关于拟南芥管状分子体外诱导培养的报道较少，而且多存在取材复杂、培养时间相对较长、细胞分散性欠佳等问题。因此，构建新的拟南芥管状分子体外诱导培养体系，对于次生壁成分积累的研究具有十分重要的意义。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种拟南芥管状分子体外诱导培养的方法，本发明的方法在拟南芥材料上适用范围更广泛、取材更简易、培养时间缩短、获得细胞分散性更好。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种拟南芥管状分子体外诱导培养的方法，步骤如下：

(1)制备拟南芥愈伤组织；

(2)在愈伤组织增殖培养基上对拟南芥愈伤组织进行扩繁培养；

(3)将扩繁后的拟南芥愈伤组织进行悬浮培养，获得分散性良好的拟南芥愈伤组织悬浮培养系；

(4)将拟南芥愈伤组织悬浮培养系采用细胞筛进行过滤，过滤后的单细胞培养系转入拟南芥管状分子体外诱导液体培养基中，进行诱导培养，诱导拟南芥愈伤组织单细胞进行分化，在体外形成管状分子。

步骤(1)中，拟南芥愈伤组织的制备方法为：将萌发后10～14天苗龄拟南芥幼苗整株切碎接入愈伤组织诱导培养基中，23～25℃暗培养，14～16天继代一次，共诱导培养28～32天，获得拟南芥愈伤组织。

所述愈伤组织诱导培养基是在B5基本培养基中添加20g/L的蔗糖、0.5mg/L的2,4-D，0.05mg/L的6-BA，6～8g/L的琼脂，调节pH为5.8。

步骤(1)中，所述拟南芥幼苗的培养方法为：挑选成熟饱满的拟南芥种子，用质量浓度为2％次氯酸钠灭菌20min，无菌水冲洗4次后，播种于MS基本培养基上。

步骤(2)中，所述愈伤组织增殖培养基是在MS基本培养基中添加30g/L的蔗糖、1mg/L的2,4-D，6～8g/L的琼脂，调节pH为5.8。

步骤(2)中，扩繁培养采用的条件为：23～25℃暗培养，15～20天继代一次，共培养30～40天。

步骤(3)中，悬浮培养采用的条件为：将扩繁后的拟南芥愈伤组织接种于MS液体培养基中，23～25℃，以180rpm转速进行振荡，暗培养，2～3天继代一次，共培养6～9天。

所述MS液体培养基是在MS基本培养基中添加30g/L的蔗糖，调节pH为5.8。

步骤(4)中，采用200目的细胞筛进行过滤。

步骤(4)中，所述拟南芥管状分子体外诱导液体培养基是在MS基本培养基中添加30g/L的蔗糖、6mg/L的NAA，1mg/L的6-BA，6μM的EBL，调节pH为5.8。

步骤(4)中，诱导培养采用的条件为：23～25℃，以180rpm转速进行振荡，持续进行暗培养。

本发明的有益效果：

(1)拟南芥管状分子体外诱导培养的初始培养采用的是拟南芥幼苗整株切碎作为外植体，材料数量多，取材容易。

(2)本发明利用拟南芥幼苗进行短期培养(两个半月至三个月)诱导新生拟南芥细胞系，适用于任何种子能够萌发的拟南芥基因型，不仅材料适用范围更加广泛，并且不必担心在继代过程中由于细胞系污染或死亡导致的材料丢失问题。

(3)本发明的拟南芥管状分子体外诱导培养的方法中，通过步骤(3)中愈伤组织的悬浮培养和步骤(4)中将愈伤组织悬浮培养系用200目细胞筛进行过滤，使获得的细胞分散性更好。

(4)拟南芥管状分子体外培养诱导率越高，越有利于后续研究工作的开展。本发明的培养方法中，首先以萌发后10～14天苗龄拟南芥幼苗整株切碎作为外植体，制备得到拟南芥愈伤组织，再对愈伤组织进行扩繁培养，通过对愈伤组织增殖培养基和扩繁培养条件的优化，提高了愈伤组织扩繁的质量；再对扩繁后的愈伤组织进行悬浮培养，通过对悬浮培养基和悬浮培养条件的优化，提高了愈伤组织悬浮培养的质量；再将悬浮培养后的细胞通过细胞筛进行过滤，提高了细胞的分散性；将过滤后的单细胞培养系进行体外诱导培养，在体外形成管状分子。上述各工艺步骤是一个有机的整体，互为条件，有效简化了拟南芥管状分子体外培养的流程，缩短了培养时间，并且提高了拟南芥管状分子体外培养的诱导率，本发明的总体诱导率在37％～50％。需要说明的是，拟南芥的体外培养诱导率是一个世界性的瓶颈问题，采用本发明的体外诱导培养方法，可以使最常见的拟南芥哥伦比亚野生型达到特殊的细胞系培养才能获得的诱导率，取得了意想不到的技术效果。

综上，本发明的拟南芥管状分子体外诱导培养的方法，与现有的培养体系相比，在拟南芥材料上适用范围更广泛、取材更简易、培养时间缩短、获得细胞分散性更好，降低诱导培养基中2，4-D使用浓度，节约成本，以无激素的MS液体基本培养基进行悬浮培养，更利于对后期管状分子分化过程中相关激素试剂的影响分析研究。

附图说明

图1：实施例1中萌发后的拟南芥幼苗；

图2：实施例1中拟南芥愈伤组织扩繁后的形貌；

图3：实施例1中拟南芥愈伤组织悬浮培养后的形貌；

图4：实施例1中体外诱导培养获得的管状分子。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明实施例中所用的培养基，具体如下：

愈伤组织诱导培养基：在B5基本培养基中添加20g/L的蔗糖、0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，0.05mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，6g/L的琼脂，调节pH为5.8；配制后用121℃高压湿热灭菌20min。

愈伤组织增殖培养基：在MS基本培养基中添加30g/L的蔗糖、1mg/L的2,4-D，8g/L的琼脂，调节pH为5.8；配制后用121℃高压湿热灭菌20min。

MS液体培养基：在MS基本培养基中添加30g/L的蔗糖，调节pH为5.8；配制后用121℃高压湿热灭菌20min。

拟南芥管状分子体外诱导液体培养基：在MS基本培养基中添加30g/L的蔗糖、6mg/L的NAA，1mg/L的6-BA，6μM的24-表油菜素内酯(EBL)，调节pH为5.8。

实施例1：拟南芥哥伦比亚野生型株系管状分子体外诱导

具体方法如下：

(1)无菌接种：挑选成熟饱满的拟南芥哥伦比亚野生型种子，用2％次氯酸钠灭菌20min，无菌水冲洗4次后，播种于MS基本培养基上。

(2)愈伤组织制备：将萌发后10天苗龄拟南芥幼苗(如图1)整株切碎接入上述配制好的愈伤组织诱导培养基中，23℃暗培养，14天继代一次，共诱导培养28天，获得拟南芥愈伤组织。

(3)愈伤组织扩繁：将诱导出的拟南芥愈伤组织转入上述配制好的愈伤组织增殖培养基中，23℃暗培养，15天继代一次，共培养30天，使拟南芥愈伤组织进行快速增殖，结果如图2所示。

(4)愈伤组织悬浮培养：将扩繁后的拟南芥愈伤组织接种于MS液体培养基中，23℃，以180rpm转速进行振荡，暗培养，2天继代一次，共培养6天，获得分散性良好的拟南芥愈伤组织悬浮培养系，结果如图3所示。

(5)管状分子体外诱导培养：将拟南芥愈伤组织悬浮培养系以200目细胞筛进行过滤，过滤后的单细胞培养系转入拟南芥管状分子体外诱导液体培养基中，23℃，以180rpm转速进行振荡，暗培养，诱导拟南芥愈伤组织单细胞进行分化形成管状分子，结果如图4所示，总体诱导率为50％。整个培养周期为75天。

实施例2：拟南芥转RABG3f-RFP基因株系管状分子体外诱导

具体方法如下：

(1)无菌接种：挑选成熟饱满的拟南芥转RABG3f-RFP基因株系种子，用2％次氯酸钠灭菌20min，无菌水冲洗4次后，播种于MS基本培养基上。

(2)愈伤组织制备：将萌发后12天苗龄拟南芥幼苗整株切碎接入上述配制好的愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养，15天继代一次，共诱导培养30天，获得拟南芥愈伤组织。

(3)愈伤组织扩繁：将诱导出的拟南芥愈伤组织转入上述配制好的愈伤组织增殖培养基中，25℃暗培养，15天继代一次，共培养30天，使拟南芥愈伤组织进行快速增殖。

(4)愈伤组织悬浮培养：将扩繁后的拟南芥愈伤组织接种于MS液体培养基中，25℃，以180rpm转速进行振荡，暗培养，2天继代一次，共培养6天，获得分散性良好的拟南芥愈伤组织悬浮培养系。

(5)管状分子体外诱导培养：将拟南芥愈伤组织悬浮培养系以200目细胞筛进行过滤，过滤后的单细胞培养系转入拟南芥管状分子体外诱导液体培养基中，25℃，以180rpm转速进行振荡，暗培养，诱导拟南芥愈伤组织单细胞进行分化形成管状分子，总体诱导率在37％，整个培养周期为80天。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明批露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。