一种香椿叶片直接再生植株的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种香椿叶片直接再生植株的方法。

背景技术：

香椿(Toona sinensis)，又名椿芽树、香椿头，为楝科香椿属高大落叶乔木，因其嫩芽有特殊香气而得名。香椿在我国分布广泛，东起辽宁，西至甘肃，南至广东、广西、云南，北至内蒙古南部，均有栽培。其中安徽、河南、山东等省栽培较多。香椿作为优良的木本蔬菜，因其具有生长速度、生态适应性强、营养价值高等优势而广受人们的喜爱，人们对香椿的需求也日益增大。

目前在生产上，由于香椿长期采用播种和扦插等传统的手段进行繁殖，虽然香椿种子育苗有利于香椿大面积造林的发展，但由于利用种子育苗时存在性状分离和遗传变异等问题，很难保持母本株系的优良性状；扦插等传统无性繁殖方式，由于受到材料的影响，繁殖系数与繁殖速度很难满足育种需求，且繁殖过程易受季节限制。植物组织培养技术因其具有繁育周期短，繁殖系数高，所需要的外植体材料少等优势，在优质苗木的规模化繁育中具有重要作用。组织培养技术可在短期内获得大量的香椿幼苗，实现香椿优良种质资源规模化生产的同时，使得加速香椿的品种改良进程成为可能。目前，有关香椿快繁的研究主要集中在以带腋芽茎段为外植体直接进行扩繁或以叶片为外植体通过愈伤组织的诱导和分化来实现香椿的繁育。前者在繁育过程中存在污染、褐化严重，繁殖系数低等问题；后者存在再生过程繁琐，愈伤组织分化效率低，且很难保持母本优良农艺性状等问题。

针对上述香椿离体繁育过程中所存在的诸多问题，同时为了满足规模化种植和品种改良对香椿优质种苗的需求，急需开发一种香椿叶片直接再生植株的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有取材方便、材料丰富、再生效率高、繁殖系数高等优点的香椿叶片直接再生植株的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种香椿叶片直接再生植株的方法，包括如下步骤：

(1)取材

选取田间多年生香椿优良株系的叶片作为外植体；

(2)外植体的预处理

将步骤(1)中的香椿叶片于0.4-0.6％的高锰酸钾溶液中浸泡2-5min，用流水冲洗10-20min，再于无菌操作台中用无菌水冲洗2-3遍；

(3)外植体的表面消毒

对完成预处理的香椿叶片进行表面消毒；

(4)不定芽的诱导

将步骤(3)中完成表面消毒的香椿叶片切成切块，接种于不定芽诱导培养基中进行不定芽的诱导培养；

(5)不定芽的增殖

待香椿叶片切块诱导出不定芽丛后，将长有不定芽丛的叶片切块转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖培养；

(6)不定芽的伸长

将步骤(5)中增殖后的不定芽丛转接于不定芽伸长培养基中进行不定芽的伸长培养；

(7)不定芽的生根

待不定芽伸长至一定条件后转入生根培养基进行生根培养，最终获得香椿试管苗。

优选地，所述步骤(1)中叶片为香椿优良株系当年生枝条的幼嫩叶片。

优选地，所述步骤(1)中香椿优良株系为具有高产或高抗特性的香椿株系。

优选地，所述步骤(3)中消毒方法为：先将预处理后的香椿叶片用70-75％的无水乙醇消毒15-25s，再用无菌水冲洗3-5遍；重复1-3次；最后，用8-12％的过氧化氢溶液消毒3-5min，无菌水冲洗5-6遍。

优选地，所述步骤(4)中完成表面消毒的香椿叶片切块以近轴端向上的方式接种于不定芽诱导培养基中。

优选地，所述步骤(4)中不定芽诱导培养基为添加有0.5-5.0mg/L ZT、0.01-0.05mg/L TDZ、2.0-10.0mg/L AgNO3、20-30g/L蔗糖和6.5-7.5g/L琼脂的DKW培养基。

优选地，所述步骤(5)中不定芽增殖培养基为添加有1.0-3.0mg/L ZT、1.0-5.0mg/L AgNO3、20-30g/L蔗糖和6.5-7.5g/L琼脂的DKW培养基。

优选地，所述步骤(6)中不定芽伸长培养基为添加有0.2-1.0mg/L ZT、0.05-0.2mg/L IBA、20-30g/L蔗糖和6.5-7.5g/L琼脂的DKW培养基。

优选地，所述步骤(7)中生根培养基为添加有0.05-0.5mg/L亚精胺、10-20g/L蔗糖和6.5-7.5g/L琼脂的1/2DKW培养基。

优选地，所述步骤(7)中不定芽伸长至一定条件的判断方法为：不定芽伸长至2-3cm，并伴有2-3个完全伸展的叶子。

优选地，所述不定芽的诱导、增殖、伸长及生根培养均在恒温培养室中进行；所述恒温培养室中培养条件为：光照/黑暗的光照周期为16/8，光照强度为2500-3000lx，温度为25-27℃。

本发明的优点在于：(1)取材方便、材料丰富；(2)再生效率高，不定芽诱导率高达88.6％，生根率高达94.7％；(3)再生速度快，繁殖系数高，且能实现对获得的无菌苗叶片的进一步扩大繁殖，为优良香椿株系的快速繁殖和品种改良提供重要的技术支持；因此，本发明所提供的一种香椿叶片直接再生植株的方法，不仅为香椿优良株系的快速繁殖和规模化生产提供了技术支撑，同时也为后期香椿的品种改良奠定了基础。

附图说明

图1是本发明实施例1-3提供的一种香椿叶片直接再生植株的方法的流程图；

图2是本发明实施例2提供的一种香椿叶片直接再生植株的方法的香椿叶片切块的不定芽诱导初期图；

图3是本发明实施例2提供的一种香椿叶片直接再生植株的方法的香椿叶片切块的不定芽诱导后期图；

图4是本发明实施例2提供的一种香椿叶片直接再生植株的方法的香椿叶片切块的不定芽增殖培养后期图；

图5是本发明实施例2提供的一种香椿叶片直接再生植株的方法的香椿叶片切块的不定芽伸长培养后期图；

图6是本发明实施例2提供的一种香椿叶片直接再生植株的方法的香椿叶片切块的不定芽生根图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种香椿叶片直接再生植株的方法，如图1所示，包括如下步骤：

(1)取材

选取田间具有高产特性的多年生香椿优良株系当年生枝条的幼嫩叶片作为外植体；

(2)外植体的预处理

将步骤(1)中的香椿叶片于0.4％的高锰酸钾溶液中浸泡2min，用流水冲洗10min，再于无菌操作台中用无菌水冲洗2遍；

(3)外植体的表面消毒

对完成预处理的香椿叶片进行表面消毒：先将预处理后的香椿叶片用70％的无水乙醇消毒15s，再用无菌水冲洗3遍；重复1次；最后，用8％的过氧化氢溶液消毒3min，无菌水冲洗5遍；

(4)不定芽的诱导

将步骤(3)中完成表面消毒的香椿叶片切成切块，再采用近轴端向上和远轴端向上两种方式分别接种于不定芽诱导培养基(添加有0.5mg/L ZT、0.01mg/L TDZ、2.0mg/L AgNO3、20g/L蔗糖和6.5g/L琼脂的DKW培养基)中，于恒温培养室中进行不定芽的诱导培养(光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度为2500lx，温度为25℃)；经过28d的培养，两种方式接种的叶片切口处均诱导出淡黄偏绿色不定芽点，但两种接种方式不定芽的诱导情况存在差异，其中以近轴端向上方式接种的叶片切块，不定芽的诱导率为48.6％，而以远轴端向上方式接种的叶片切块，不定芽的诱导率仅为21.8％；

(5)不定芽的增殖

待香椿叶片切块诱导出不定芽丛后，将长有不定芽丛的叶片切块转接于不定芽增殖培养基(添加有1.0mg/L ZT、1.0mg/L AgNO3、20g/L蔗糖和6.5g/L琼脂的DKW培养基)中，于恒温培养室中进行不定芽的增殖培养(光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度为2500lx，温度为25℃)；培养25d后，获得不定芽丛，平均不定芽个数为3.6个；

(6)不定芽的伸长

将步骤(5)中增殖后的不定芽丛转接于不定芽伸长培养基(添加有0.2mg/L ZT、0.05mg/L IBA、20g/L蔗糖和6.5g/L琼脂的DKW培养基)中，于恒温培养室中进行不定芽的伸长培养(光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度为2500lx，温度为25℃)；培养21d后，获得长度为2cm，并伴有2个完全伸展叶子的不定芽；

(7)不定芽的生根

将伸长的不定芽转入生根培养基(添加有0.05mg/L亚精胺、10g/L蔗糖和6.5g/L琼脂的1/2DKW培养基)中，于恒温培养室中进行生根培养(光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度为2500lx，温度为25℃)，不定根的诱导率高达68.5％，且平均每个不定芽的基部长出2.6个细长的不定根，最终获得香椿试管苗。

实施例2

一种香椿叶片直接再生植株的方法，如图1所示，包括如下步骤：

(1)取材

选取田间多年生香椿优良株系当年生枝条的幼嫩叶片作为外植体；

(2)外植体的预处理

将步骤(1)中的香椿叶片于0.5％的高锰酸钾溶液中浸泡4min，用流水冲洗15min，再于无菌操作台中用无菌水冲洗2遍；

(3)外植体的表面消毒

对完成预处理的香椿叶片进行表面消毒：先将预处理后的香椿叶片用73％的无水乙醇消毒20s，再用无菌水冲洗4遍；重复2次；最后，用10％的过氧化氢溶液消毒4min，无菌水冲洗6遍；

(4)不定芽的诱导

将步骤(3)中完成表面消毒的香椿叶片切成切块，再采用近轴端向上的方式接种于不定芽诱导培养基(添加有2.0mg/L ZT、0.03mg/L TDZ、5.0mg/L AgNO3、25g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的DKW培养基)中，于恒温培养室中进行不定芽的诱导培养(图2)((光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度为2800lx，温度为26℃)；经过21d的培养，叶片切口处诱导出淡绿色不定芽点(图3)，且不定芽的诱导率为88.6％；

(5)不定芽的增殖

待香椿叶片切块诱导出不定芽丛后，将长有不定芽丛的叶片切块转接于不定芽增殖培养基(添加有2.0mg/L ZT、3.0mg/L AgNO3、25g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的DKW培养基)中，于恒温培养室中进行不定芽的增殖培养(光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度为2800lx，温度为26℃)；培养28d后，获得不定芽丛，平均不定芽个数为8.2个(图4)；

(6)不定芽的伸长

将步骤(5)中增殖后的不定芽丛转接于不定芽伸长培养基(添加有0.5mg/L ZT、0.1mg/L IBA、25g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的DKW培养基)中，于恒温培养室中进行不定芽的伸长培养(光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度为2800lx，温度为26℃)；培养21d后，获得长为2.5cm，并伴有3个完全伸展叶子的不定芽(图5)；

(7)不定芽的生根

待不定芽伸长至2.5cm，并伴有3个完全伸展的叶子时转入生根培养基(添加有0.2mg/L亚精胺、15g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的1/2DKW培养基)中，于恒温培养室中进行生根培养(光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度为2800lx，温度为26℃)，培养21d后，不定芽的基部长出大量健壮的不定根(图6)，不定根的诱导率高达93.5％，且平均每个外植体产生4.7个不定根，最终获得香椿试管苗。

实施例3

一种香椿叶片直接再生植株的方法，如图1所示，包括如下步骤：

(1)取材

选取田间具有高抗特性的多年生香椿优良株系当年生枝条的幼嫩叶片作为外植体；

(2)外植体的预处理

将步骤(1)中的香椿叶片于0.6％的高锰酸钾溶液中浸泡5min，用流水冲洗20min，再于无菌操作台中用无菌水冲洗3遍；

(3)外植体的表面消毒

对完成预处理的香椿叶片进行表面消毒：先将预处理后的香椿叶片用75％的无水乙醇消毒25s，再用无菌水冲洗5遍；重复3次；最后，用12％的过氧化氢溶液消毒5min，无菌水冲洗6遍；

(4)不定芽的诱导

将步骤(3)中完成表面消毒的香椿叶片切成切块，再采用近轴端向上的方式接种于不定芽诱导培养基(添加有5.0mg/L ZT、0.05mg/L TDZ、10.0mg/L AgNO3、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的DKW培养基)中，于恒温培养室中进行不定芽的诱导培养(图2)(光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度为3000lx，温度为27℃)；经过21d的培养，叶片切口处诱导出大量的淡绿色不定芽点(图3)，且不定芽的诱导率为73.7％；

(5)不定芽的增殖

待香椿叶片切块诱导出不定芽丛后，将长有不定芽丛的叶片切块转接于不定芽增殖培养基(添加有3.0mg/L ZT、5.0mg/L AgNO3、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的DKW培养基)中，于恒温培养室中进行不定芽的增殖培养(光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度为3000lx，温度为27℃)；培养28d后，获得不定芽丛，且平均每个外植体产生4.5个不定芽(图4)。

(6)不定芽的伸长

将步骤(5)中增殖后的不定芽丛转接于不定芽伸长培养基(添加有1.0mg/L ZT、0.2mg/L IBA、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的DKW培养基)中，于恒温培养室中进行不定芽的伸长培养(光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度为3000lx，温度为27℃)；培养21d后，获得长为3cm，并伴有3个完全伸展叶子的不定芽(图5)。

(7)不定芽的生根

将伸长的不定芽转入生根培养基(添加有0.5mg/L亚精胺、20g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的1/2DKW培养基)中，于恒温培养室中进行生根培养(光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度为3000lx，温度为27℃)，培养21d后,不定芽的基部长出大量短小的不定根，不定根的诱导率高达94.7％，且平均每个外植体产生6.2个不定根，最终获得香椿试管苗。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。