本发明属于植物菌根技术领域，特别涉及香蕉菌根组织培养种苗生产技术。
背景技术：
香蕉是我国南方地区重要的经济作物，目前，制约我国香蕉产业健康发展的两大问题是香蕉主产区枯萎病病害严重和土壤肥力偏低。香蕉枯萎病又名香蕉巴拿马病，黄叶病，是一种由古巴专化型尖孢镰刀菌侵染维管束引起植株凋萎的毁灭性真菌土传病害。丛枝菌根(am)真菌是菌根真菌的一种，能促进植物宿主对水分和养分(特别是磷)的吸收和利用，在促进植物生长、改善土壤生态、抑制土传病害和提高植株抗病性方面极具应用潜力的微生物资源。
利用香蕉组织培养技术，规模化生产香蕉种苗，能有效提高香蕉种苗质量。同时，利用菌根技术，在移栽时对组培苗进行高效菌根真菌的人工辅助接种，实现种苗菌根化，这对提高香蕉组织培养苗的移栽成活率、改善其生长状况将起到至关重要的作用。但是目前在香蕉的实际生产中，未见有am菌根在香蕉组培苗上的应用，更没有找到一种具有明显促生作用的am菌剂。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明分离得到一株丛枝菌根真菌的优势菌株，地表球囊霉lcgx-58，用该菌株制成am菌剂，在适宜的共生培养体系条件下，对香蕉有显著的促生功能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株地表球囊霉(glomusversiforme)lcgx-58，保藏编号为cgmccno.8775。
本发明提供了上述技术方案所述地表球囊霉lcgx-58在制备地表球囊霉(glomusversiforme)lcgx-58菌剂中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述地表球囊霉lcgx-58菌剂的制备方法，包含以下步骤：
(a)以玉米为宿主，将地表球囊霉lcgx-58的孢子接种于玉米幼苗根系，种植、培养；
(b)长出地表球囊霉菌丝后，对所述步骤(a)培养中的玉米停止浇水，待植株干枯后除去茎秆，保留根系，培养基质中所得菌丝、培养基质和玉米根系即为地表球囊霉lcgx-58菌剂。
优选的，步骤(a)中的玉米幼苗种植于培养基质中，大棚光照培养12～16周。
优选的，所述培养基质包括河砂和沸石；
优选的，所述河沙和沸石的体积比为2:1～3:1；
优选的，所述培养基质使用前经过灭菌处理。
优选的，lcgx-58菌剂包含培养基质中所得菌丝、培养基质和玉米根系。
本发明还提供了上述技术方案所述lcgx-58菌剂在香蕉生产中的应用，包含以下步骤：
(1)将香蕉植株的吸芽无菌处理后修剪成带生长点的茎尖，将所述茎尖在温度为25℃～28℃、光强度为2000～3000lx、光照时间为l2h·d-1的培养条件下依次进行诱导培养35～40天、继代培养25～30天和生根培养20～30天，得到香蕉组培苗；
(2)将所述步骤(1)得到的香蕉组培苗进行为期15～20天的炼苗；
(3)将所述步骤(2)炼苗后的香蕉组培苗移栽至育苗培养基上进行培养，所述育苗培养基包括体积比为1:1～1:2的地表球囊霉lcgx-58菌剂与育苗基质。
优选的，所述步骤(3)的培养过程中进行养护管理，所述养护管理具体为：盖塑料薄膜保湿15～20天，保持湿度70～80％；在所述培养过程中，每2周喷施一次hoagland′s营养液。
优选的，步骤(1)中所述诱导培养用诱导培养基包括ms基础培养基、占所述ms基础培养基浓度为2～5mg/l的ba和占所述ms基础培养基浓度为0.1～0.2mg/l的naa。
优选的，步骤(1)中所述继代培养用继代培养基包括ms基础培养基、占所述ms基础培养基浓度为1～3mg/l的ba和占所述ms基础培养基浓度为0.05～0.15mg/l的naa。
优选的，步骤(1)中所述生根培养用生根培养基包括1/2ms基础培养基、占所述1/2ms基础培养基浓度为0.1～0.2mg/l的naa和占所述1/2ms基础培养基浓度为0.1～0.5％的活性炭。
技术效果
本发明分离得到一株丛枝菌根真菌的优势菌株，地表球囊霉lcgx-58，用该菌株制成am菌剂，所得菌剂对香蕉生长有很好的促进作用，适应力以及定殖力强，能促进香蕉对土壤中养分的吸收，促进香蕉植株生长。进一步的本发明将植物组织培养、菌根化育苗和大棚移栽技术相结合，建立一套香蕉菌根化组织培养种苗育苗的技术体系，为香蕉的工厂化生产提供技术支持，同时也为其它植物的菌根化育苗，快速繁殖提供相关技术依据。
生物保藏说明
地表球囊霉(glomusversiforme)lcgx-58，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2014年01月16日，保藏号：cgmccno.8775。
附图说明
图1为地表球囊霉lcgx-58的菌株形态特征；
图2为采用本发明制备所得地表球囊霉lcgx-58菌剂在香蕉种植中应用后所得香蕉菌根植株，其中am为添加地表球囊霉lcgx-58菌剂的香蕉菌根植株，ck为未添加菌剂的空白对照；
图3为地表球囊霉lcgx-58菌剂与对照组香蕉植株根系菌根侵染检测，其中a为菌丝，b为泡囊，c为丛枝，d为对照组。
具体实施方式
本发明提供了一株地表球囊霉(glomusversiforme)lcgx-58，生物保藏编号为cgmccno.8775。
优选的，地表球囊霉lcgx-58的形态特征为：孢子：土壤中单生，球形或近球形，黄至黄棕色，显微镜下沿孢壁有一圈深色，大小82～136μm；
孢子壁：孢壁3层，l1无色透明易逝壁，约1μm，成熟时常脱落或只剩部分残屑；l2浅黄至黄棕色层状壁，厚2～4μm，厚度较均匀；l3单一壁，约1μm，不易与l2分离，亮金黄色；
连孢菌丝：无色透明，宽4.3～6.8μm，成熟孢子中常萎缩或脱落。连点宽7.6～12.0μm，直或小喇叭形，开放或由一内壁形成的隔封闭；
内含物：油滴状。
本发明公开了地表球囊霉lcgx-58在制备地表球囊霉(glomusversiforme)lcgx-58菌剂中的应用。
本发明提供了所述地表球囊霉lcgx-58菌剂的制备方法，包含以下步骤：
(a)以玉米为宿主，将地表球囊霉lcgx-58的孢子接种于发芽玉米种子，种植、培养；
(b)长出地表球囊霉菌丝后，对所述步骤(a)培养中的玉米停止浇水，待植株干枯后除去茎秆，保留根系，培养基质中所得菌丝、培养基质和玉米根系即为地表球囊霉lcgx-58菌剂。
本发明中，将根系中接种了地表球囊霉孢子的发芽玉米种子种植于培养基质中进行培养。优选的，接种方法为：用移液枪将单个孢子放置于发芽玉米种子附近或混合。
在本发明中，所述培养基质用来培养发芽玉米种子，优选包括河砂和沸石；所述河沙和沸石的体积比优选为2:1～3:1，更优选为3:1。在本发明中，所述培养基质使用前优选经过灭菌处理，本发明对所述灭菌的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的培养基质灭菌技术方案即可；具体的在本发明的实施例中可采用高压蒸汽灭菌；所述的灭菌处理优选为：在121℃、103.4kpa条件下高压蒸汽灭菌1h。
本发明中，所述宿主的种植密度优选的为35～45株/盆，更优选的为40株/盆，所述盆的规格为上表面直径×下表面直径×盆高为780×350×250mm。密度太大，植物根系太密集，不利于孢子的侵染；密度小，根系过少，不利于孢子的生长繁殖。
在本发明中，所述培养为光照培养；所述光照培养的光照度优选为2000～3000lx，更优选为2500lx；本发明优选在光照培养12～16周时，长出地表球囊菌菌丝，更优选为13～15周，最优选的为14周。优选的，所述的地表球囊菌菌丝已经侵染玉米根系，达到共生状态。所述培养的温度优选为室温，浇水的频次优选1～2天/次，浇水量优选为达到湿润不沾手即可。
长出地表球囊霉菌丝后，本发明对所述培养中的玉米停止浇水，待植株干枯后除去茎秆，保留根系，得到的培养基质中的菌丝、培养基质和玉米根系即为地表球囊霉lcgx-58菌剂。
本发明还提供了一种地表球囊霉菌剂，具体为上述技术方案所述制备方法得到的培养基质中的菌丝、培养基质和玉米根系，更优选的，为培养基质中的菌丝与培养基质的混合物。所述菌剂经检测后直接使用，优选的，菌剂检测孢子浓度，达到80～120孢子/g。
本发明还提供了上述技术方案所述lcgx-58菌剂在香蕉生产中的应用，包含以下步骤：
(1)将香蕉植株的吸芽无菌处理后修剪成带生长点的茎尖，将所述茎尖在温度为25℃～28℃、光强度为2000～3000lx、光照时间为l2h·d-1的培养条件下依次进行诱导培养35～40天、继代培养25～30天和生根培养20～30天，得到香蕉组培苗；
(2)将所述步骤(1)得到的香蕉组培苗进行为期15～20天的炼苗；
(3)将所述步骤(2)炼苗后的香蕉组培苗移栽至育苗培养基上进行培养，所述育苗培养基包括体积比为1:1～1:2的地表球囊霉lcgx-58菌剂与育苗基质。
本发明以茎尖作为香蕉培养的原料，具体的将香蕉植株的吸芽无菌处理后修剪成带生长点的茎尖。无菌处理的方法为清水洗去表层泥土，剥除叶鞘和不定根，分别用洗衣粉水和自来水洗涤并冲洗干净，实验室操作时，带入接种室，用酒精棉球擦拭后，在超净工作台上，再次层层剥去假茎叶鞘；
得到带有生长点的茎尖后，本发明将所述茎尖依次进行诱导培养、继代培养和生根培养。本发明中，所述诱导培养用诱导培养基优选包括ms基础培养基、占所述ms基础培养基浓度为2～5mg/l的ba和占所述ms基础培养基浓度为0.1～0.2mg/l的naa；更优选包括ms基础培养基、占所述ms基础培养基浓度为4mg/l的ba和占所述ms基础培养基浓度为0.15mg/l的naa。
在本发明中，所述诱导培养的温度为25℃～28℃，更优选为26℃；光照强度为2000～3000lx，优选为2500lx；光照时间为l2h·d-1。在本发明中，所述诱导培养的时间为35～40天，优选为40天。
诱导培养后，本发明将得到的培养苗转移至继代培养基中进行继代培养。在本发明中，所述继代培养用继代培养基优选包括ms基础培养基、占所述ms基础培养基浓度为1～3mg/l的ba和占所述ms基础培养基浓度为0.05～0.15mg/l的naa；更优选包括ms基础培养基、占所述ms基础培养基浓度为2.5mg/l的ba和占所述ms基础培养基浓度为0.1mg/l的naa。
在本发明中，所述继代培养的温度为25℃～28℃；光照强度为2000～3000lx，优选为2500lx；光照时间为l2h·d-1。在本发明中，所述继代培养的时间为25～30天，优选为30天。
继代培养后，本发明将得到的培养苗转移至生根培养基中进行生根培养。在本发明中，所述生根培养用生根培养基优选包括1/2ms基础培养基、占所述1/2ms基础培养基浓度为0.1～0.2mg/l的naa和占所述1/2ms基础培养基浓度为0.1～0.5％的活性炭；更优选包括1/2ms基础培养基、占所述1/2ms基础培养基浓度为0.15mg/l的naa和占所述1/2ms基础培养基浓度为0.5％的活性炭。
在本发明中，所述生根培养的温度为25℃～28℃；光照强度为2000～3000lx，优选为2500lx；光照时间为l2h·d-1。在本发明中，所述生根培养的时间为20～30天，优选为30天。
得到香蕉组培苗后，本发明将所述香蕉组培苗进行炼苗。在本发明中，所述炼苗的时间为15～20天，优选为18天。
所述炼苗后，本发明将得到的炼苗后的香蕉组培苗移栽至育苗培养基上进行育苗培养，所述育苗培养基包括体积比为1:1～1:2的地表球囊霉lcgx-58菌剂与育苗基质。在本发明中，所述育苗基质为本领域常规基质，主要成分为草炭、蛭石、珍珠岩、大量元素及微量元素。
在本发明中，所述育苗培养过程在大棚中进行，在所述育苗培养的过程中进行养护管理，所述养护管理优选包括：在移栽后盖塑料薄膜保湿15～20天、保持湿度70～80％；所述育苗培养期间每2周喷施一次hoagland′s营养液。在本发明中，所述保湿的时间更优选为18天；所述棚内的湿度更优选为75％。在本发明中，所述育苗培养期间喷施的hoagland′s营养液的浓度优选为25～50％，更优选为40％；所述hoagland′s营养液的喷施量优选为每株100ml。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
地表球囊霉lcgx-58的筛选过程如下：
(1)从广西柳城县采集的多年宿根甘蔗根际土壤10g作为培养物放入食品搅拌机杯中，加入600ml去离子水5000rpm离心3～5s；
(2)将步骤(1)中高速离心所得物质倒出，依次通过3个土壤标准筛(孔径为上层0.8mm，中间0.25mm，下层0.0385mm)，大部分砂砾余留在食品搅拌机杯中，用流水冲洗每层筛子，直至流出的水是清水；
(3)下层筛子里的残余物转至质量浓度为60％蔗糖的离心管中，1500转/min离心3min，离心管中上清液迅速倒至孔径0.0385mm筛子；
(4)用水冲洗筛子中的上清液遗留物1～2min后转移至玻璃培养皿，体视显微镜观察孢子；
(5)在体视显微镜下先观察记录孢子的颜色、大小、连孢菌丝的特征、孢子果形态等；在此基础上，用毛细吸管挑取新鲜的am真菌孢子置于载玻片上，依次添加水、乳酸、乳酸甘油、pvlg等浮载剂后，在nikone-600显微镜下观察，记录孢子的形状、大小、颜色、表面纹饰，孢子内含物、连孢菌丝的数目、宽度及形状、孢壁结构，辅助细胞(土生泡囊)，外生菌丝及附属结构产孢子囊等特征；同时辅助使用melzer's试剂、棉蓝试剂，观察孢子的特异反应(是否有浅湖蓝色)，对有代表性或特异性的特征进行拍照；根据孢子的形态特征，采用schüβler&walker(2010)的分类系统，并参阅schenck&perez(1988)的“va菌根真菌鉴定手册和相关网站：http://invam.caf.wvu.edu(invam,westvirginiauniversity,usa)；http://www.zor.zut.edu.pl/glomeromycota/taxonomy.html(departmentofplantpathology,universityofagricultureinszczecin,poland)及http://www.lrz.de/～schuessler/amphylo/amphylogeny.html的鉴定资料以及近几年发表新种的原始描述，进行种属的检索、鉴定。对于难确定的种或可能的新种、新记录种进一步进行单孢培养，一部分获得大量的同源孢子，再确定种类，另一部分采用分子生物学方法辅助鉴定。am真菌孢子以melzer's:pvlg＝1:1或pvlg为浮载剂制成玻片标本，密封、编号、并进行贮藏。
结果
(一)菌株形态特征
孢子：土壤中单生，球形或近球形，黄至黄棕色，显微镜下沿孢壁有一圈深色，大小82～136μm，如图1所示。
孢子壁：孢壁3层，l1无色透明易逝壁，约1μm，成熟时常脱落或只剩部分残屑；l2浅黄至黄棕色层状壁，厚2～4μm，厚度较均匀；l3单一壁，约1μm，不易与l2分离，亮金黄色。
连孢菌丝：无色透明，宽4.3～6.8μm，成熟孢子中常萎缩或脱落。连点宽7.6～12.0μm，直或小喇叭形，开放或由一内壁形成的隔封闭。
内含物：油滴状。
(二)鉴定结果
综合形态学和分子生物学特征，将菌株鉴定为glomusversiforme。
实施例2
(a)以玉米为宿主，将地表球囊霉lcgx-58的单孢子接种于发芽玉米种子附近或混合，种植于经121℃高压蒸汽下灭菌1h、河沙：沸石＝3:1体积比的河沙沸石培养基质中，大棚光照培养15周，即得地表球囊霉菌丝；光照培养期间每7～10天浇注质量浓度为25～50％的hoagland营养液100ml；其中，种植采用盆栽(780×350×250mm)生产模式，宿主密度为40株/盆；
(b)将步骤(a)中培养12～16周的玉米停止浇水，待植株干枯后除去茎秆，保留根系，培养基质中所得菌丝、培养基质和保留的玉米根系即为地表球囊霉lcgx-58菌剂，所得菌剂中孢子量为80～120个孢子/g，培养基质中除了有菌丝还含有地表球囊霉的孢子；接种量按照每盆(780×350×250mm)玉米使用100g地表球囊霉lcgx-58菌剂。
实施例3
菌株菌剂在香蕉生产中的应用，操作步骤如下：
(1)组培苗培养：在无传统病害的香蕉区，选用长势健壮、挂果整齐、产量高的母株，挖取其刚露出地面的完整吸芽，用清水冲净外表泥土，剥除吸芽外面的叶鞘及不定根，再用自来水冲洗干净，用小刀将吸芽剪切成5×7cm(直径×高)大小，装入灭过菌的瓶子。在超菌工作台上用酒精棉球擦拭进行外植体灭菌后，依次剥去各层假茎叶鞘，修剪成3×3.5cm(直径×高)大小带生长点的吸芽，用酒精(0～1min)+升汞(12～18min)，无菌水冲洗5次，以茎尖为中心纵切成2～4块，接入诱导培养基{ms+ba(4.0mg/l)+naa(0.15mg/l)}中进行诱导培养，诱导培养40d后在继代培养基{ms+ba(2.5mg/l)+naa(0.1mg/l)}中进行继代培养，继代培养30d后在生根培养基{1/2ms+naa(0.15mg/l)+活性炭0.5％}中进行生根培养，生根培养条件为在温度25℃～28℃，光强度2000～3000lx，光照时间l2h·d-1，即得香蕉组培苗；
(2)香蕉组培苗炼苗：取步骤(1)中所得的具有5～6条根和3～4片叶的香蕉组培苗，进行为期15～20天的炼苗；
(3)步骤(2)中组培苗经过炼苗后，将具有6～8条根、4～6片叶以上的香蕉组培苗进行移栽，将上述制备所得地表球囊霉lcgx-58菌剂与育苗基质(育苗基质主要成分为草炭、蛭石、珍珠岩和大量元素及微量元素)按体积比1:1混合，将香蕉组培苗在该培养基上培养；
(4)养护管理：盖塑料薄膜保湿15～20天，保持湿度70～80％，30天后按照正常组培苗管理，同时每2周喷施一次50％hoagland营养液，培育2～3个月后种植大田。
实施例4
香蕉根系菌根检测：
实验组(am)：将实施例2得到的菌剂按实施例3的方法应用到香蕉种植中；
对照组(ck)：不添加菌剂，其他操作与实验组完全相同。
香蕉苗移植到大田中种植后3个月，从实验组(am)和对照组(ck)中随机抽取5株苗进行菌根侵染检测。香蕉根系用自来水冲洗干净，滤纸吸干水。将根系剪成1cm长根段，加20％koh溶液完全浸泡根系，90℃水浴15min后用自来水轻轻冲洗3次，并将水分控干，加入碱性h2o2脱色1.5h后除去深色根系表层的颜色，同时软化根系，脱色结束后用清水冲洗3-5次并将水分控干。加入体积浓度5％的冰乙酸，室温酸化5min，倒掉冰乙酸溶液；加入5％醋酸墨水染色(5ml派克纯黑书写墨水+95ml家用白醋)，66℃水浴染色30min后，倒去染液，用清水冲洗数次后，在清水中脱色(时间为>12h)。将脱色根断置于载玻片上，挑取脱色处理后的根段平展于载玻片上，每片平行摆放2个根段，盖上24mm×50mm盖玻片，用手指将根段稍用力压扁。使用奥林巴斯bx53-32p02显微镜观察和拍照,并记录香蕉苗的生长状况，如表1所示：
表一：am组与对照组ck的香蕉苗生长指标对比
上述对香蕉植株根系进行am侵染检测，结果如图3所示，图3中a为菌丝，b为泡囊，c为丛枝，d为对照组。由图3可以看出，显微镜下可观察到菌根组培苗的根系有明显的菌丝、丛枝及孢子(图3a、b、c)。
由以上实施例可知，实验组(am)中香蕉组培苗移栽后与菌剂共生培养60天后，与对照组的香蕉苗相比表现出旺盛的生长势，植株叶片深绿，叶片数多，叶片长，植株健壮(图2)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。