【技术领域】
本发明涉及植物培育繁殖技术领域，具体涉及一种香樟的组织培养方法。
背景技术：
香樟树是一种重要的多种用途生态和经济树种，其木材致密美观，具有芳香味，防虫击蚊之用；香樟树树姿秀丽，四季常青且枝叶茂密，具有很强吸尘能力和抗雾霾能力；香樟树的木材、根、叶及果实皆含精油，是天然樟脑，芳香油和芳香醇的重要来源，其精油和芳香醇价格每吨18-32万之间，其精加工产品涉及众多领域和行业。
在培育过程中，香樟树通常以种子进行繁殖，后代变异极大，扦插繁殖和分蘖繁殖等能最大限度保持母本优良特性，生产成本相对较低，而随着香樟树特色资源利用水平的不断提高，特别是产业脱贫项目上，扦插繁殖难于在短时间内满足规模化生产的需求，还具有根系不发达，浪费枝条等缺点，因此，研究出一种缩短其育苗时间、提高出芽存活率，满足规模化生产的香樟组培技术有着十分重要的意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于，提供一种香樟的组织培养方法，本发明的香樟的组织培养方法在含有不同激素配比的wpm培养基上诱导香樟的愈伤组织，通过诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基的培养，获得香樟的再生苗，其培养方法取材方便，材料来源、数量充足，容易获得无菌材料，能够用较少的优良母本，繁殖出大批量的种苗，适用于规模化生产。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
一种香樟的组织培养方法，具体包括如下步骤：
(一)外植体的预处理：剪取经过挖根处理后长出的嫩芽作为外植体，将外植体剪成4-6cm的条状物，然后用大蒜汁将外植体浸泡15-30min(浸泡时间长短视材料木质化程度而定)，浸泡过程不断进行振荡，浸泡完成后用无菌水将外植体冲洗4-6次，然后放置于无菌接种盘吹干其表面水分，切去叶片以及旧的切口，切成2-2.5cm带3个芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，用滤纸吸干带芽茎段备用；
(二)培养基的培养：
(1)诱导培养：将上述步骤获得的带芽茎段先接种到诱导培养基上，黑暗条件下培养5-10天，然后按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养，诱导新芽长高至4-5cm后，将新芽的叶片切去，切成2-3cm的茎段；
所述诱导培养基含有wpm培养基+2.5mg/l6-ba+0.25mg/lnaa+4.5g/l琼脂+30g/l蔗糖；
(2)增殖培养：将步骤(1)培养后处理得到的茎段接种到增殖培养基上培养35-40天后，将新芽转到新的增殖培养基培养，增殖倍数达到3-4倍；
所述增殖培养基的成分为：wpm+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.5g/l琼脂+25g/l蔗糖；
(3)生根培养：将经步骤(2)增殖培养得到的丛芽切除其多余的侧面芽或不定芽，按照高度为1.5-3cm将具有单芽的小枝剪切下来，然后将剪切后的小枝放到生根培养基进行生根培养，培养24-26天后即可出瓶炼苗；
所述生根培养基的成分为：wpm+2.0mg/l生根粉+4.5g/l琼脂+30g/l蔗糖；
上述三种培养基的制备方法是将组成培养基的原料混合搅拌均匀后，将其煮沸至ph值调节至5.6-6.0，然后装入培养器皿中，在120-123℃高温下蒸汽灭菌15-20min后进行冷却，得到培养基备用；
(三)大棚炼苗：用镊子将小苗从培养器皿中取出，用自来水将小苗根部的培养基洗净，然后种植到培养土苗盘里并喷淋定根水，待叶面干后，喷施800-1000倍液的农用链霉毒，7-15天后喷施20-30倍的沼气液，在大棚内培育3-5个月后进行移栽。
优选地，所述组织培养方法还包括外植体准备的步骤，具体为：通过检测取含精油量和芳香醇高的香樟树作为母体，将母体进行挖根处理，经过挖根处理待断根处长出嫩芽后，取断根位置新长出的嫩芽作为外植体。
优选地，步骤(1)所述诱导培养是在温度为26-28℃，湿度为65-80％，ph值为5.6-6.0的条件下进行的，诱导培养中的光照为自然光照2000-2500lux。
优选地，步骤(2)所述增殖培养是在温度为26-28℃，湿度为50-75％，ph值为5.6-6.0的条件下进行的，所述增殖培养光照强度为2000-3000lux，光照时度为12-14h/天。
优选地，步骤(3)所述生根培养是在温度为24-27℃，湿度为40-60％，ph值为5.6-6.0，光照强度为2000-3000lux，光照时度为12-14h/天的条件下进行的。
优选地，步骤(3)所述生根粉为abt1号生根粉。
优选地，所述作为外植体的嫩芽为4-6月份非下雨天期间长出的嫩芽。
本发明经大棚炼苗得到的香樟苗从大棚内取出，放入清水盆中，洗去根部琼脂，然后捞出，用多菌灵处理后移栽至营养土中，营养土上层为2cm河沙，下层为4cm珍珠岩、蛭石及腐殖质混合物，待有新叶长出后按常规苗圃育苗措施管理。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明的一种香樟的组织培养方法在选择外植体时，选择通过检测取含精油量和芳香醇高的香樟树作为母体，将母体进行挖根处理，经过挖根处理待断根处长出嫩芽后，取断根位置新长出的嫩芽作为外植体，用上述方法得到的外植体可以有效的保持了优良母本的稳定性状，通过组织培养对外植体进行处理，与常规的扦插和压条繁殖相比，组织培养能够用较少的优良母本，繁殖出大批量的种苗，适用于规模化生产。
2、本发明的香樟的组织培养方法在含有不同激素配比的wpm培养基上诱导愈伤组织，通过诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基的培养，获得香樟的再生苗，其培养方法取材方便，材料来源、数量充足，容易获得无菌材料；筛选获得植株再生的香樟无性系，可大大提高农杆菌介导遗传转化的转基因获得率，有效缩短香樟的遗传转化周期，是一套易于掌握、简便节约、快速高效的再生体系。
【具体实施方式】
下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不可以以任何方式限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种香樟的组织培养方法，具体包括如下步骤：
(一)外植体的准备：通过检测取含精油量和芳香醇高的香樟树作为母体，将母体进行挖根处理，经过挖根处理待断根处长出嫩芽后，取断根位置新长出的嫩芽作为外植体，其中，嫩芽为4-6月份非下雨天期间长出的嫩芽；
(二)外植体的预处理：剪取经过挖根处理后长出的嫩芽作为外植体，将外植体剪成4cm的条状物，然后用大蒜汁将外植体浸泡15min，浸泡过程不断进行振荡，浸泡完成后用无菌水将外植体冲洗4次，然后放置于无菌接种盘吹干其表面水分，切去叶片以及旧的切口，切成2cm带3个芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，用滤纸吸干带芽茎段备用；
(三)培养基的培养：
(1)诱导培养：将上述步骤获得的带芽茎段先接种到诱导培养基上，黑暗条件下培养5天，然后按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养，诱导新芽长高至4cm后，将新芽的叶片切去，切成2cm的茎段；诱导培养是在温度为26℃，湿度为65％，ph值为5.6的条件下进行的，诱导培养中的光照为自然光照2000lux；其中，诱导培养基含有wpm培养基+2.5mg/l6-ba+0.25mg/lnaa+4.5g/l琼脂+30g/l蔗糖；
(2)增殖培养：将步骤(1)培养后处理得到的茎段接种到增殖培养基上培养35天后，将新芽转到新的增殖培养基培养，增殖倍数达到3倍；增殖培养是在温度为26℃，湿度为50％，ph值为5.6的条件下进行的，所述增殖培养光照强度为2000lux，光照时度为12h/天；其中，增殖培养基的成分为：wpm+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.5g/l琼脂+25g/l蔗糖；
(3)生根培养：将经步骤(2)增殖培养得到的丛芽切除其多余的侧面芽或不定芽，按照高度为1.5cm将具有单芽的小枝剪切下来，然后将剪切后的小枝放到生根培养基进行生根培养，培养24天后即可出瓶炼苗；生根培养是在温度为24℃，湿度为40％，ph值为5.6，光照强度为2000lux，光照时度为12h/天的条件下进行的；其中，生根培养基的成分为：wpm+2.0mg/labt1号生根粉+4.5g/l琼脂+30g/l蔗糖；
上述三种培养基的制备方法是将组成培养基的原料混合搅拌均匀后，将其煮沸至ph值调节至5.6，然后装入培养器皿中，在120℃高温下蒸汽灭菌15min后进行冷却，得到培养基备用；
(四)大棚炼苗：用镊子将小苗从培养器皿中取出，用自来水将小苗根部的培养基洗净，然后种植到培养土苗盘里并喷淋定根水，待叶面干后，喷施800倍液的农用链霉毒，7天后喷施20倍的沼气液，在大棚内培育3个月后进行移栽。
实施例2
本实施例提供一种香樟的组织培养方法，具体包括如下步骤：
(一)外植体的准备：通过检测取含精油量和芳香醇高的香樟树作为母体，将母体进行挖根处理，经过挖根处理待断根处长出嫩芽后，取断根位置新长出的嫩芽作为外植体，其中，嫩芽为4-6月份非下雨天期间长出的嫩芽；
(二)外植体的预处理：剪取经过挖根处理后长出的嫩芽作为外植体，将外植体剪成5cm的条状物，然后用大蒜汁将外植体浸泡22min，浸泡过程不断进行振荡，浸泡完成后用无菌水将外植体冲洗5次，然后放置于无菌接种盘吹干其表面水分，切去叶片以及旧的切口，切成2.2cm带3个芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，用滤纸吸干带芽茎段备用；
(三)培养基的培养：
(1)诱导培养：将上述步骤获得的带芽茎段先接种到诱导培养基上，黑暗条件下培养7天，然后按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养，诱导新芽长高至4cm后，将新芽的叶片切去，切成2cm的茎段；诱导培养是在温度为27℃，湿度为75％，ph值为5.8的条件下进行的，诱导培养中的光照为自然光照2250lux；其中，诱导培养基含有wpm培养基+2.5mg/l6-ba+0.25mg/lnaa+4.5g/l琼脂+30g/l蔗糖；
(2)增殖培养：将步骤(1)培养后处理得到的茎段接种到增殖培养基上培养38天后，将新芽转到新的增殖培养基培养，增殖倍数达到3倍；增殖培养是在温度为27℃，湿度为65％，ph值为5.8的条件下进行的，所述增殖培养光照强度为2500lux，光照时度为13h/天；其中，增殖培养基的成分为：wpm+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.5g/l琼脂+25g/l蔗糖；
(3)生根培养：将经步骤(2)增殖培养得到的丛芽切除其多余的侧面芽或不定芽，按照高度为1.9cm将具有单芽的小枝剪切下来，然后将剪切后的小枝放到生根培养基进行生根培养，培养25天后即可出瓶炼苗；生根培养是在温度为25℃，湿度为50％，ph值为5.8，光照强度为2500lux，光照时度为13h/天的条件下进行的；其中，生根培养基的成分为：wpm+2.0mg/labt1号生根粉+4.5g/l琼脂+30g/l蔗糖；
上述三种培养基的制备方法是将组成培养基的原料混合搅拌均匀后，将其煮沸至ph值调节至5.8，然后装入培养器皿中，在122℃高温下蒸汽灭菌17min后进行冷却，得到培养基备用；
(四)大棚炼苗：用镊子将小苗从培养器皿中取出，用自来水将小苗根部的培养基洗净，然后种植到培养土苗盘里并喷淋定根水，待叶面干后，喷施900倍液的农用链霉毒，12天后喷施25倍的沼气液，在大棚内培育4个月后进行移栽。
实施例3
本实施例提供一种香樟的组织培养方法，具体包括如下步骤：
(一)外植体的准备：通过检测取含精油量和芳香醇高的香樟树作为母体，将母体进行挖根处理，经过挖根处理待断根处长出嫩芽后，取断根位置新长出的嫩芽作为外植体，其中，嫩芽为4-6月份非下雨天期间长出的嫩芽；
(二)外植体的预处理：剪取经过挖根处理后长出的嫩芽作为外植体，将外植体剪成6cm的条状物，然后用大蒜汁将外植体浸泡30min，浸泡过程不断进行振荡，浸泡完成后用无菌水将外植体冲洗6次，然后放置于无菌接种盘吹干其表面水分，切去叶片以及旧的切口，切成2.5cm带3个芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，用滤纸吸干带芽茎段备用；
(三)培养基的培养：
(1)诱导培养：将上述步骤获得的带芽茎段先接种到诱导培养基上，黑暗条件下培养10天，然后按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养，诱导新芽长高至5cm后，将新芽的叶片切去，切成3cm的茎段；诱导培养是在温度为28℃，湿度为80％，ph值为6.0的条件下进行的，诱导培养中的光照为自然光照2500lux；其中，诱导培养基含有wpm培养基+2.5mg/l6-ba+0.25mg/lnaa+4.5g/l琼脂+30g/l蔗糖；
(2)增殖培养：将步骤(1)培养后处理得到的茎段接种到增殖培养基上培养40天后，将新芽转到新的增殖培养基培养，增殖倍数达到4倍；增殖培养是在温度为28℃，湿度为75％，ph值为6.0的条件下进行的，所述增殖培养光照强度为3000lux，光照时度为12-14h/天；其中，增殖培养基的成分为：wpm+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.5g/l琼脂+25g/l蔗糖；
(3)生根培养：将经步骤(2)增殖培养得到的丛芽切除其多余的侧面芽或不定芽，按照高度为3cm将具有单芽的小枝剪切下来，然后将剪切后的小枝放到生根培养基进行生根培养，培养26天后即可出瓶炼苗；生根培养是在温度为27℃，湿度为60％，ph值为6.0，光照强度为3000lux，光照时度为14h/天的条件下进行的；其中，生根培养基的成分为：wpm+2.0mg/labt1号生根粉+4.5g/l琼脂+30g/l蔗糖；
上述三种培养基的制备方法是将组成培养基的原料混合搅拌均匀后，将其煮沸至ph值调节至6.0，然后装入培养器皿中，在123℃高温下蒸汽灭菌20min后进行冷却，得到培养基备用；
(四)大棚炼苗：用镊子将小苗从培养器皿中取出，用自来水将小苗根部的培养基洗净，然后种植到培养土苗盘里并喷淋定根水，待叶面干后，喷施1000倍液的农用链霉毒，15天后喷施30倍的沼气液，在大棚内培育5个月后进行移栽。
效果验证
为了进一步说明本发明香樟的组织培养方法的应用价值，实施人分为以下四组做对比试验：
第一组：实施例1所述的组织培养方法；
第二组：实施例2所述的组织培养方法；
第三组：实施例3所述的组织培养方法；
第四组：培养基配方更换为wpm培养基+2.5mg/l6-ba+0.5mg/liba-d+30g/l蔗糖，其他方式严格按照实施例2进行。
s1：观察上述四组在组培苗情况，记录各组的生根苗数、生根率和多根率，结果见表1；
表1四组香樟组培苗情况表
根据上表可知：采用本发明的组织培养方法培育得到的香樟种苗，生根苗数多，生根率以及多根率高，适用于大规模种植，值得推广。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。