一种桔梗叶片的快速诱芽及组培繁殖方法与流程

本发明属于通过组织培养技术的植物再生领域，具体地涉及一种桔梗叶片的快速诱芽及组培繁殖方法。

背景技术：

桔梗(Platycodon grandiflorus)，有祛痰、利咽、镇咳、排脓、宽胸顺气之功效，其水提取液也具有抗癌作用。近年来，随着其保健及医疗功能为人所熟知，其价格也不断上涨，导致市场上桔梗供不应求，因此，提高桔梗的种苗繁殖速度对满足市场对桔梗种苗的需求有重要意义，也将会带来巨大的经济效益。

目前，桔梗的繁殖方式主要有：种子繁殖、育苗移栽、扦插以及组织离体培养，其中又以种子繁殖为主要的繁殖方式。种子繁殖需要留种、选种、进行发芽实验、播种、田间管理等步骤，而且播种时除种子本身需要浸种催芽，对田间的温湿度也有较高要求，其出苗的时间也都在10-15天左右，生长周期为2-3年，而且种子的寿命一般只有1年，当年的发芽率也只有70%左右，种子繁殖也容易导致品质退化，因此采用种子繁殖的方法限制了桔梗生产的发展。而育苗移栽的方法，虽然周期只有一年但其步骤依然比较繁琐，且对人工、气温、水分、土壤要求较高，不便操作，而且产量低于种子繁殖。桔梗也可以进行扦插繁殖，但其属于宿根草本，喜欢低湿干燥的环境，采用扦插的方法易感染病虫害，而且生根率低，导致成活率不高，因此生产上运用较少。

植物组织离体培养因不受外界环境条件影响，可利用少量材料短时间内培养出大量无菌苗木，因此被广泛运用于苗木的快速繁殖。在传统的组培快繁技术中，其操作流程一般为：叶片、茎段等外植体→形成愈伤组织→愈伤组织继代培养增殖→愈伤诱导成芽→诱导生根→驯化移栽成苗。目前，因为采用叶片进行组织培养丛生芽的诱导率不高，桔梗的组织离体培养主要采用幼嫩的茎段、茎尖进行快繁。然而茎段、茎尖的外植体数量远低于叶片的外植体数量，而且，以茎为外植体（如不含茎节）无法做到不经愈伤直接诱导成芽，培养周期较长；如果是含有茎节的茎段则可以做到不经愈伤直接诱导成芽，但繁殖系数较低，只有2倍。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供了一种桔梗叶片的快速诱芽及组培繁殖方法，该发明以叶片切块作为外植体直接进行芽的诱导分化，分化率达到98%以上，繁殖（增殖）系数达10.15倍，并且从叶片切块到形成成熟芽只需要20天左右，大大减少了成芽周期。

一种桔梗叶片组培繁殖的快速诱芽方法，包括对桔梗种子处理并萌发培养获得桔梗叶片的步骤，将所得桔梗叶片去柄切块得叶片切块的步骤，其特征在于：将叶片切块作为外植体，转入芽诱导培养基中进行培养，不经愈伤组织的形成与增殖阶段，直接诱导产生分化芽；

所述的芽诱导培养基为pH= 5.8的MS培养基，向其中添加工作浓度分别为 1mg/L的 6-苄氨基嘌呤（6-BA）、0.1mg/L的萘乙酸（NAA）、6.5g/L的琼脂粉和30g/L的蔗糖；

所述转入芽诱导培养基中进行培养的条件为：温度23 ± 2 ℃，光照时间12h/d，光照强度2000 lx。

进一步的，所述外植体在芽诱导培养基上培养20d即可产生分化芽。

进一步的，所述叶片切块的大小为0.5cm × 0.5cm。

上述桔梗叶片组培繁殖的快速诱芽方法，还包括对桔梗种子处理并萌发培养获得桔梗叶片的步骤，其操作方法为：将桔梗种子在赤霉素溶液中浸泡，再经消毒剂消毒，接种到MS基础培养基中进行培养，待种子萌发长出7-10片叶子时，获取无菌试管苗，取其叶片。

进一步的，所述的赤霉素溶液的浓度为250 mg/L，浸泡时间为8h。

进一步的，所述的消毒剂消毒步骤为：先用75%酒精消毒10 s，然后用1.5 g/L HgCl2 消毒10-15 min。

利用所述诱芽方法进行桔梗叶片组培繁殖的方法，其特征在于：进行快速诱芽后，将所得的分化芽从基部切下，转入生根培养基中培养30-35天，获得无菌桔梗苗，待条件成熟后即可进行移栽。

进一步的，所述的生根培养基为pH=5.8的1/2 MS培养基，向其中添加工作浓度分别为0.5 mg/L 的吲哚丁酸（IBA）、0.5 mg/L 的NAA、6.5 g/L的琼脂粉和30 g/L。

本发明的有益效果：

1、本发明所述方法中所用外植体是将桔梗种子处理萌发至一定程度后取叶片并切块，在此过程中，将种子首先在250 mg/L的高浓度赤霉素溶液（GA₃）中浸泡8h进行预处理，打破种子休眠，增加种子中游离型赤霉素的含量，促进发芽，同时使发芽产生的试管苗组织中的赤霉素含量高于一般水平，促进诱芽；之后消毒，防止霉菌污染影响试管苗生长活力，经上述综合处理，种子发芽率达95%以上，生长发育状态良好，浓度与预处理时间的有效结合避免了莲座状生长或茎段徒长，待长至7-10片叶子时剪取叶片，此时试管苗生长趋于健壮，同时叶片细胞分裂能力较强，去柄切块后作为外植体，来源丰富，残存的赤霉素能继续促进发芽，为外植体快速诱芽奠定基础。

2、本发明利用种子获得的无菌试管苗叶片切块为外植体，结合特定培养基与激素配比，所用发芽培养基为pH= 5.8的MS培养基，还包含1mg/L的6-BA、0.1mg/L 的NAA和30g/L的蔗糖，其中，6-BA的活性较高，能促进外植体内物质积累和细胞分裂，促进芽的形成，同时也可诱导愈伤组织发生，加入的NAA进入到外植体内，随同营养流疏导到作用部位，特定的6-BA和NAA的激素含量配比，加之预处理中赤霉素的后续影响，可抑制愈伤的形成，加速芽的生成诱导，这样就省去了愈伤组织形成和增殖两个阶段的培养时间，从叶片切块到形成成熟芽（能够用于生根的芽/苗）只需要20天左右，而通常通过叶片切块长愈伤再由愈伤诱导成芽需要 35-50天，大大缩短了生长周期，且其叶片诱导芽的分化率达到98%以上，对科学研究与工业生产带来了便利，节约成本。

3、对桔梗的组织培养来说，从试验结果及研究文献来看，以根为外植体还无法做到不经愈伤直接诱导成芽；以茎为外植体（如不含茎节）也无法做到不经愈伤直接诱导成芽；如果是含有茎节的茎段则可以做到不经愈伤直接诱导成芽，但繁殖系数较低，只有2倍，而利用本发明方法，其繁殖系数可达10.15倍，高出约10%。所以，本发明所述方法繁殖系数高能够得到大量桔梗苗，便于进行规模化生产。

附图说明

图1是叶片切块接种到芽诱导培养基上培养20天时苗分化及长势情况；

图2是分化芽转入生根培养基培养35d的生根情况；

图3是0.1mg/L 6-BA和0.05 mg/L NAA两种生长调节剂组合对丛生芽的诱导情况。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式对本发明做进一步的解释说明。

实施例1

培养基的配置：

MS基础培养基：MS培养基 + 琼脂粉6.5 g/L + 蔗糖30 g/L，pH 5.8；

芽诱导培养基：MS培养基 + 6-BA 1 mg/L + NAA 0.1 mg/L + 琼脂粉6.5 g/L + 蔗糖30 g/L，pH 5.8；

生根培养基组成为1/2 MS培养基 + 0.5 mg/L IBA + 0.5 mg/L NAA +琼脂粉6.5 g/L + 蔗糖30 g/L，pH 5.8。

选取饱满、健康的桔梗种子，在250 mg/L的赤霉素（GA3）溶液中浸泡8h，用无菌水冲洗后进行消毒，首先将桔梗种子置于75%酒精中处理10s，无菌水冲洗一次，之后于1.5 g/L的 HgCl₂ 溶液中浸泡10-15 min，用无菌水冲洗4-5次，达到消毒的目的。将经消毒的种子置于无菌滤纸上，吸干表面水分，接种于MS基础培养基上，以上步骤均在超净工作台上操作。然后将接种种子的MS基础培养基置于组织培养间进行培养，组织培养间的条件设定为：温度23±2℃、光照时间每天12 h和光照强度2000 lx。培养至种子萌发成苗，苗上叶子为7-10片时，获得无菌试管苗。

在无菌条件下，取无菌试管苗的叶片，去柄，用手术刀将其切成约0.5 cm × 0.5 cm大小的切块，将叶片切块转入芽诱导培养基中，置于组织培养间培养20d，叶片切块边沿分化产生丛生芽，在无菌条件下将丛生芽从其基部切下，分别转入生根培养基中，生根培养30-35d，获得桔梗苗。之后即可进行常规炼苗与移栽。

试验例1 桔梗常规组培方法

1、材料及处理

以桔梗种子为试材，首先将种子放入三角瓶中用自来水浸泡数小时，再用加有少量洗洁精的自来水浸泡10-15min，用自来水冲洗干净；加入75%的酒精中消毒1min，用蒸馏水冲洗1-2次；将种子转入灭菌的三角瓶中，加入0.1%升汞液浸泡杀菌10min，用无菌水冲洗5-6次；将经消毒的种子放在无菌滤纸上，吸干表面水分，接种到MS基础培养基上，接种完成后将其置于25℃培养箱中培养，带种子萌发长出3-5片叶子时，即可作为外植体。

2、培养程序

将培养好的无菌苗从培养容器中取出，将叶片剪成0.5-1cm的小块，叶面朝上，接种于愈伤组织诱导培养基上，培养2-3周，即可见外植体表面形成很多愈伤组织。其中，愈伤组织培养基配方为：MS培养基 + 6-BA 0.8-1.5mg/L + IAA 0.3-0.7mg/L +蔗糖20g/L+琼脂 5-7g/L，pH=5.8。

将带有愈伤组织的外植体转入芽诱导培养基中，培养3-4周，即可从愈伤组织上形成许多不定芽，又称丛生芽。其中，芽诱导培养基配方为：MS培养基 + 6-BA 0.3-0.5mg/L，pH=5.8。将丛生芽从基部切下，置于同一培养基上培养，可长成较大的无根试管苗。

将无根试管苗转移至生根培养基上培养，培养3-4周诱导其生根长成桔梗苗，随后可移栽。其中，生根培养基配方为:1/2 MS培养基+ IAA 0.3-0.5mg/L + IBA 0.01-0.03mg/L + 蔗糖 20-25g/L + 琼脂 5.5g/L，pH=5.8.

将实施例1与试验例1进行综合评价，首先采用实施例1方法可完成快速生芽，从叶片切块到形成丛生芽（能够用于生根的芽/苗）只需要20天左右，且丛生芽产量较多，而试验例1方法通过叶片切块长愈伤再由愈伤诱导成芽需要约 35-50天，只培养愈伤组织就需要21-28天，相比来说，实施例1方法加快了生芽，大大缩短了生长周期，节约成本。另外，如图1，实施例1所得丛生芽在生根培养之前就有少量根发生分化，且丛生芽只有轻微玻璃化现象，而常规的试验例1丛生芽无根分化，玻璃化现象可达50%，严重影响桔梗苗的产量。

相对于试验例1，实施例1所得桔梗苗生长更为健壮，茎、叶和根均发育良好，如图2，平均每株苗生根数为9条，平均根长为2.5cm，且根毛较发达。

试验例2 不同生长调节物质对丛生芽的诱导影响分析

配置芽诱导培养基时，综合考虑桔梗生长发育和组织培养需求，结合前期试验结果，确定6-BA和NAA两种生长调节剂的组合，针对组合中两种成分的含量分别三个水平，如下表1所示。

表1：两因素三水平设计

根据表1中6-BA和NAA的两因素三水平，设计下表2中九个处理实验，除培养基外，其他处理及培养条件与实施例1相同，最后对这九组试验所得分化苗的增值系数和生长情况进行分析，其中，繁殖系数是指用一块外植体平均能够繁殖得到多少株芽（苗）。

表2：各处理及其分化生长情况

由表2可以看出，1mg/L浓度的6-BA最适合叶片分化，相比较而言0.1mg/L NAA优于0.5mg/L和0.05mg/L NAA的组合。接种到含1mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的芽诱导培养基上培养20d的桔梗无菌苗叶片切块的分化生长情况优于其他组合，生长状态良好，分化出大量丛生芽，其中玻璃化现象轻微且有少量根已分化，如图1。其他生长调节剂组合下的分化情况均不太理想，以处理9为例，分化情况如图3所示，仅有极少量丛生芽，且茎发育不够健壮，均出现倒伏，虽有根分化，但增值系数相比较低。