本发明涉及一种利用抗敏蛋白LSP1促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法，属于中药甘草组织培养领域。
背景技术：
甘草酸(Glycyrrhizic acid)属于E型皂苷的一种，是甘草中含量最丰富的皂苷。作为甘草中最主要的活性成分，甘草酸主要有以下几种用途：(1)医药工业：甘草酸具有抗炎保肝、抗病毒、抗肿瘤、干扰素诱生剂，调节免疫功能等作用，临床应用于慢性肝炎、支气管炎和艾滋病及多种癌症的防治。(2)食品及卷烟业：甘草酸是一种高甜度低热值的保健甜味剂，其甜度约为蔗糖的250倍以上，添加于食品，饮料，糖果中作甜味剂，可克服多用糖而引起的发酵，酸败等缺点，而且有杀菌、洁齿、消炎、润喉等功用。(3)化妆品工业：甘草酸分子中含有亲水性基团和亲油性基团，能降低水溶液表面张力，有很强的发泡力，具有乳化、分散、保湿润发、软化皮肤、抗皱、抗皮脂、防治色素沉积、消炎止痒及洗涤去污的效果。
尽管甘草酸有如此之多的用途，但从甘草或甘草不定根中进行提取，其收率较低，难于满足工业生产的需要。
目前尚未有利用抗敏蛋白LSP1促进甘草不定根中甘草酸积累的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的甘草不定根组培方法中甘草酸化合物含量较低的不足，提供一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法，包括如下步骤：
(1)将甘草的根、茎或叶接种于固体培养基中诱导甘草不定根的生成，将甘草不定根接种于液体培养基中，培养33-37天；
所述固体培养基用下述方法配成：在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3-4％，加入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L，加入琼脂使终质量浓度为0.6-0.7％，调节pH＝5.8-6.0；
所述液体培养基用下述方法配成：在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L，调节pH＝5.8-6.0；
(2)将抗敏蛋白LSP1加入到步骤(1)已培养33-37天的甘草不定根的液体培养基中，使抗敏蛋白LSP1的终浓度为25-200mg/L，继续培养4-6天，收获，所述抗敏蛋白LSP1用SEQ ID NO.1所示。
步骤(2)抗敏蛋白LSP1的终浓度为50mg/L。
本发明的优点：
本发明的方法具有操作简单，能显著提高甘草不定根中甘草酸化合物含量，生长周期短，生产成本低，便于甘草酸的工业化大规模生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
MS培养基，商品化。
PDA培养基，(20％土豆+2％葡萄糖+2％琼脂,余量是水)
实施例1
固体培养基用下述方法配成：在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3.5％，加入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L，加入琼脂使终质量浓度为0.65％，调节pH＝5.9。
实施例2
固体培养基用下述方法配成：在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为4％，加入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L，加入琼脂使终质量浓度为0.6％，调节pH＝5.8。
实施例3
固体培养基用下述方法配成：在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L，加入琼脂使终质量浓度为0.7％，调节pH＝6.0。
实施例4
液体培养基用下述方法配成：在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L，调节pH＝5.9。
实施例5
液体培养基用下述方法配成：在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L，调节pH＝5.8。
实施例6
液体培养基用下述方法配成：在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L，调节pH＝6.0。
实施例7
一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法，包括如下步骤：
(1)将甘草的根接种于实施例1配制的固体培养基中诱导甘草不定根的生成，将甘草不定根接种于实施例4配制的液体培养基中，培养35天；
(2)将抗敏蛋白LSP1加入到步骤(1)已培养35天的甘草不定根的液体培养基中，使抗敏蛋白LSP1的终浓度为50mg/L，继续培养5天，收获，所述抗敏蛋白LSP1用SEQ ID NO.1所示。
实施例8
一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法，包括如下步骤：
(1)将甘草的茎接种于实施例2配制的固体培养基中诱导甘草不定根的生成，将甘草不定根接种于实施例5配制的液体培养基中，培养33天；
(2)将抗敏蛋白LSP1加入到步骤(1)已培养33天的甘草不定根的液体培养基中，使抗敏蛋白LSP1的终浓度为25mg/L，继续培养6天，收获，所述抗敏蛋白LSP1用SEQ ID NO.1所示。
步骤(2)抗敏蛋白LSP1的终浓度为50mg/L。
实施例9
一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法，包括如下步骤：
(1)将甘草的叶接种于实施例3配制的固体培养基中诱导甘草不定根的生成，将甘草不定根接种于实施例6配制的液体培养基中，培养37天；
(2)将抗敏蛋白LSP1加入到步骤(1)已培养37天的甘草不定根的液体培养基中，使抗敏蛋白LSP1的终浓度为200mg/L，继续培养4天，收获，所述抗敏蛋白LSP1用SEQ ID NO.1所示。
步骤(2)抗敏蛋白LSP1的终浓度为50mg/L。
实施例10
甘草不定根的组培方法(对照组)，包括如下步骤：
将甘草根接种于实施例1配制的固体培养基中诱导甘草不定根的生成，将甘草不定根接种于实施例4配制的液体培养基中，培养40天，收获。
实施例11
各实施例获得的甘草不定根中甘草酸化合物的提取及含量测定：
(1)色谱条件
液相色谱条件：色谱柱为Kromasil C18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相A：乙腈，B：0.05％磷酸；梯度洗脱程序：0～8min，A：19％；8～35min，A为19～50％；35～36min，A为50～100％；36～40min，A为100～19％。检测波长237nm；柱温30℃；流速1.0mL·min-1；进样体积为20μL。
(2)标准品溶液的制备
精密称取甘草酸标品1mg，加少量甲醇超声溶解后置于5mL容量瓶中，再用甲醇定容至刻度，分别得到甘草酸对照品储备液。对照品储备液用0.22μm微孔滤膜过滤后密封，置冰箱中保存备用。
(3)样品溶液的制备
精密称取0.2g实施例7、8、9、10获得的甘草不定根，干燥后获得的甘草不定根样品分别置于50mL具塞三角瓶中，各加入20mL甲醇，超声提取(250W，40kHz)30min，然后60℃水浴振荡器振荡90min，过滤，滤渣再加入20mL甲醇，超声提取(250W，40kHz)30min，然后60℃水浴振荡器振荡90min，过滤，合并滤液。挥干(提取物)，再加入1mL甲醇超声溶解，再加甲醇定容至1mL，用高效液相色谱仪。
实验结果：实施例7、8、9、10测定的甘草酸含量依次为0.41mg/g、0.32mg/g、0.28mg/g、0.12mg/g。
抗敏蛋白LSP1由北京华大蛋白公司鉴定，其序列(SEQ ID NO.1)为：
SEQUENCE LISTING
<110> 天津大学
<120> 一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 341
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae strain
<400> 1
Met His Arg Thr Tyr Ser Leu Arg Asn Gln Arg Ala Pro Thr Ala Ala
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ser Thr Lys Ser Lys Phe
20 25 30
Phe Gly Lys Ala Ser Ile Ala Ser Ser Phe Arg Lys Asn Ala Ala Gly
35 40 45
Asn Phe Gly Pro Glu Leu Ala Arg Lys Leu Ser Gln Leu Val Lys Thr
50 55 60
Glu Lys Gly Val Leu Arg Ala Met Glu Val Val Ala Ser Glu Arg Arg
65 70 75 80
Glu Ala Ala Lys Gln Leu Ser Leu Trp Gly Ala Asp Asn Asp Asp Asp
85 90 95
Val Ser Asp Val Thr Asp Lys Leu Gly Val Leu Ile Tyr Glu Leu Gly
100 105 110
Glu Leu Gln Asp Gln Phe Ile Asp Lys Tyr Asp Gln Tyr Arg Val Thr
115 120 125
Leu Lys Ser Ile Arg Asn Ile Glu Ala Ser Val Gln Pro Ser Arg Asp
130 135 140
Arg Lys Glu Lys Ile Thr Asp Glu Ile Ala His Leu Lys Tyr Lys Asp
145 150 155 160
Pro Gln Ser Thr Lys Ile Pro Val Leu Glu Gln Glu Leu Val Arg Ala
165 170 175
Glu Ala Glu Ser Leu Val Ala Glu Ala Gln Leu Ser Asn Ile Thr Arg
180 185 190
Glu Lys Leu Lys Ala Ala Tyr Ser Tyr Met Phe Asp Ser Leu Arg Glu
195 200 205
Leu Ser Glu Lys Phe Ala Leu Ile Ala Gly Tyr Gly Lys Ala Leu Leu
210 215 220
Glu Leu Leu Asp Asp Ser Pro Val Thr Pro Gly Glu Ala Arg Pro Ala
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Tyr Glu Ala Ser Arg Gln Ile Ile Met Asp Ala Glu Ser
245 250 255
Ala Leu Glu Ser Trp Thr Leu Asp Met Ala Ala Val Lys Pro Thr Leu
260 265 270
Ser Phe His Gln Thr Val Asp Asp Val Tyr Glu Asp Glu Asp Gly Glu
275 280 285
Glu Glu Glu Glu Pro Glu Ile Gln Asn Gly Asp Ile Pro Gly Gln Val
290 295 300
Val Glu Glu Glu Glu Val Glu Trp Thr Thr Glu Val Pro Val Asp Asp
305 310 315 320
Glu Ala His Glu Ala Asp His His Val Ser Gln Asn Gly His Thr Ser
325 330 335
Gly Ser Glu Asn Ile
340