本发明涉及一种植物的培养方法，具体涉及一种获取甜叶菊组织培养用无菌外植体的方法。
背景技术：
菊科植物甜叶菊Stevia rebaudiana Bertoni，是一种多年生菊科草本植物，叶片含甜菊糖苷，其甜度为蔗糖的150～300倍，是一种极好的天然甜味剂。目前，来源于甜叶菊的甜菊糖苷已被卡夫、百事可乐、可口可乐等食品和饮料公司用来替代蔗糖生产低热量的食品和饮料，不但无副作用，而且能治疗某些疾病，如治糖尿病、降血压，对肥胖症、心脏病、小儿虫齿等也有疗效，并有促进新陈代谢、强健身体的作用。我国是甜叶菊叶片和甜菊糖苷的主要生产和出口国，甜叶菊的病虫害少，抗逆性强，适应性广，生长最适温度为20～25℃，长江以南地区一般都可自然越冬，我国南北方都已大面积种植。
甜叶菊离体培养技术在甜叶菊产业中具有基础性作用。为提高农业种植效益，需要在甜叶菊种质资源保存的基础上，利用生物技术开展甜叶菊新种质的创制及新品种的选育，并利用组织培养、原生质体培养等繁殖技术来迅速获取大量植株，促进优良甜叶菊品种的选育和推广栽培利用。植物离体培养技术在优良种苗繁殖中，具有繁殖速度快、不受环境影响、周年生产等特点，能够在短期内生产大量幼苗。在从甜叶菊种质资源保存到优异品种推广应用的育种研究中，甜叶菊离体培养技术具有基础性作用，其中甜叶菊无菌培养技术体系的建立应用是关键。
在利用甜叶菊材料进行组织培养时，现有的技术方案都是以甜叶菊植株作为外植体的直接供体，即，直接从甜叶菊植株上剪去枝条、茎秆或叶片等作为外植体，在利用酒精、升汞等进行表面消毒后，进行组织培养。由于在田间种植中，甜叶菊组织内部会积累赤霉菌等内生菌，在表面消毒接种后，外植体消毒难度高、杂菌污染率高，最终导致甜叶菊组织培养成功率低。
解决这一问题的关键点就是如何通过外植体供体材料的前期处理，获得没有内生菌污染的外植体。
技术实现要素：
本发明的发明目的在于：针对在利用甜叶菊植株作为外植体供体进行组织培养时，外植体消毒难度、杂菌污染率高、组织培养成功率低这一制约甜叶菊无菌培养技术体系顺利建成关键问题，提供一种获取甜叶菊无菌外植体的方法，为基于组织培养技术的甜叶菊材料快繁、种质保存、生物技术操作等提供适宜的无菌外植体材料。
本发明采用的技术方案如下：
一种获取甜叶菊组织培养用无菌外植体的方法，以甜叶菊植株、枝条、根蔸或根为获取外植体的初始材料，将初始材料进行培养，获取萌蘖、分生幼苗、新生腋芽、枝条或主茎的新生顶端作为组织培养用的无菌外植体，这些外植体经表面消毒后即可接种利用。如果需要扩大无菌外植体数量，可以前述萌蘖、分生幼苗、腋芽、枝条或主茎的新生顶端作为繁殖材料，进一步繁殖后再作为外植体接种利用。
所述的获取甜叶菊组织培养用无菌外植体的方法，优选包括以下步骤：
1)初始材料的选取：以甜叶菊植株、枝条、根蔸或根为获取外植体的初始材料；
2)初始材料的培养：将甜叶菊植株、枝条、根蔸或根等初始材料进行培养，使腋芽或不定芽萌发、原有枝条或主茎的顶端抽生；
3)无菌外植体的收获：待步骤2)萌蘖、分生幼苗、腋芽、枝条或主茎的新生顶端达到适宜大小后，剪取前述新生萌蘖、分生幼苗、腋芽、枝条或主茎的新生顶端作为甜叶菊组织培养用无菌外植体的供体材料，经表面消毒后作为外植体接种利用；
4)无菌外植体的扩大：也可以以步骤3)所获得的萌蘖、分生幼苗、腋芽、枝条或主茎的新生顶端作为繁殖材料，经过进一步繁殖后再作为外植体接种利用。
所述甜叶菊初始材料为室内外培育的各种甜叶菊品种。
所述甜叶菊初始材料可以为各生育期的甜叶菊植株的根、根蔸、枝条及甜叶菊植株自身。
所述初始材料是现有方法可以培养的甜叶菊植株的各种部位，包括但不仅限于甜叶菊植株的根、根蔸、枝条及甜叶菊植株本身。
所述无菌外植体可以是利用包括但不仅限于甜叶菊植株、枝条、根蔸或根等初始材料进行培养而形成的包括但不仅限于萌蘖、分生幼苗、腋芽、新生顶端等新形成的植物材料，而不包括植株顶部原有顶端及原有叶片。
所述无菌外植体也可以是以包括但不仅限于以前述萌蘖、分生幼苗、腋芽、新生顶端等材料进一步繁殖后所获取的任何形式的植物材料。
所述初始材料的培养获取甜叶菊无菌外植体方法及无菌外植体的进一步扩大繁殖方法可以是包括但不仅限于基质扦插培养、水培、气雾栽培、无菌栽培等各种室内外培养方法的单独或联合应用。
所述初始材料的培养获取甜叶菊无菌外植体及无菌外植体的进一步扩大繁殖的时间可长可短，可随培养材料的种类、培养方法而长短不同。
依照本发明获得的无菌外植体的方法操作简便，可以完全在不使用其他材料的情况下，从甜叶菊植株上直接获取可以用于组织培养等无菌操作的无菌外植体。
依照本发明获得的无菌外植体的，其内生菌较其初始材料甜叶菊植株下降明显，后期组培污染率明显降低。
依照本发明获得的无菌外植体，采用常规的表面消毒措施，无须延长酒精和升汞等表面消毒剂处理时间，减小了表面消毒过程对外植体的伤害，大幅度地提高甜叶菊组培成功率。
本发明摒弃了以往直接从甜叶菊植株上剪去叶片或茎段进行以组织培养为代表的甜叶菊无菌培养的方式，采用先在室内或室外对甜叶菊植株、枝条、根蔸或根进行培养，获取萌蘖、分生幼苗、新生腋芽、枝条或主茎的新生顶端作为组织培养用的无菌外植体，重点解决了以组织培养为代表的甜叶菊无菌培养的以下几个问题：
1)由于本发明降低了外植体中内生菌的量，可以为以组织培养为代表的甜叶菊无菌培养提供优质的无菌外植体。
2)由于在本发明无菌外植体获取过程中，可以减少或避免各种化学杀菌剂的大剂量使用，减少了对外植体的伤害，确保了外植体活力，也提高了后期组织培养成功率。
3)由于本发明摒弃了以往直接从甜叶菊植株获取外植体进行培养的方式，降低了外植体中内生菌的量，这为基于无菌培养的田间及野外优异甜叶菊种质的保存繁殖提供了技术支撑。
4)由于在本发明无菌外植体获取过程中，可以减少或避免各种化学杀菌剂的大剂量使用，减少了对外植体的诱变，可以更好地保存甜叶菊资源的原有性状，适用于甜叶菊种质资源保存相关的无菌培养。
综上所述，由于本发明摒弃了以往直接从甜叶菊植株上剪去外植体进行以组织培养为代表的甜叶菊无菌培养的方式，采用先在室内或室外对甜叶菊植株、枝条、根蔸或根进行培养，获取新生的腋芽、萌蘖、分生幼苗、枝条或主茎的新生顶端作为组织培养用的无菌外植体，本发明的有益效果是：
本发明突破甜叶菊无菌培养中外植体的传统获取方式，提供了一种获取甜叶菊组织培养用无菌外植体的方法，为以组织培养为代表的甜叶菊无菌培养提供优质的无菌外植体；减少或避免了外植体获取过程中各种化学杀菌剂的大剂量使用，确保了外植体活力，提高了后期组织培养成功率；降低了外植体中内生菌的量，为基于无菌培养的田间及野外优异甜叶菊种质保存繁殖提供了技术支撑；由于减少或避免各种化学杀菌剂的大剂量使用，减少了对外植体的诱变，可以更好地保存甜叶菊资源的原有性状，更加适用于甜叶菊种质资源保存相关的无菌培养。
具体实施方式
下面结合实施例和对比例说明本发明的具体实施方式和技术效果，本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1：
初始材料的选取：选取生长势较好的甜叶菊大田植株枝条作为初始材料。
初始材料的培养：将所取枝条(含3-4个节)去掉多余的叶片，将其长度的4/5--7/8深埋扦插，覆10cm左右厚度的疏松有机土，给予其所需的适当养料及水分。
无菌外植体的获取：温度15-25℃，适当遮光处理14-21天，剪取甜叶菊枝条上萌生的腋芽作为无菌外植体在超净工作台上进行常规的表面消毒后接种培养。
实施例2：
初始材料的选取：选取生长势较好的甜叶菊大田植株枝条作为初始材料。
初始材料的培养：将所取枝条用流水冲洗30-50min，以去除杂菌及粉尘，之后将枝条置于添加有250倍多菌灵悬浮剂的蒸馏水中，培养10-14天待幼嫩枝条从腋芽中抽生出来；培养条件为：培养温度(25±1)℃，光照强度2500Lx，光照/黑暗时间16/8h，剪取甜叶菊枝条上萌生的腋芽作为无菌外植体在超净工作台上进行常规的表面消毒后接种培养。
实施例3：
初始材料的选取：选取生长势较好的甜叶菊大田植株作为初始材料。
初始材料的培养：将所取植株，去除地上部，植株基部留10cm左右长，覆10cm左右厚度的疏松有机土，给予其所需的适当养料及水分。
无菌外植体的获取：温度15-25℃，适当遮光处理14-21天，剪取甜叶菊植株基部枝条上萌生的腋芽作为无菌外植体在超净工作台上进行常规的表面消毒后接种培养。
实施例4：
初始材料的选取：选取生长势较好的甜叶菊大田植株作为初始材料。
初始材料的培养：将所取植株，去除地上部，植株基部留10cm左右长，覆5cm左右厚度的疏松有机土，给予其所需的适当养料及水分。
无菌外植体的获取：温度15-25℃，适当遮光处理14-21天，剪取从根部萌生的分蘖作为无菌外植体在超净工作台上进行常规的表面消毒后接种培养。
实施例5：
初始材料的选取：选取生长势较好的甜叶菊大田植株作为初始材料。
初始材料的培养：将所取植株连同根部一起移栽到营养钵内，覆5cm左右厚度的疏松有机土，给予其所需的适当养料及水分。
无菌外植体的获取：温度35-42℃，光照强度500Lx，弱光处理7-14天，剪取从茎秆或枝条上抽生的新的枝条或顶芽作为无菌外植体在超净工作台上进行常规的表面消毒后接种培养。
对比例：
直接从甜叶菊大田植株上剪取从茎秆作为外植体在超净工作台上进行常规的表面消毒后接种培养。
说明：上述所有实施例和对比例中外植体的表面消毒都参照常规措施进行。即，使用流水冲洗5-10min，以去除表面杂质，将冲洗过的外植体在超净工作台上进行外植体表面消毒，先用75％酒精浸泡10s，弃去酒精，再用0.4％多菌灵溶液浸泡30min，弃去多菌灵溶液，再用0.1％的升汞溶液浸泡5min，浸泡过程中持续晃动溶液以确保消毒效果，最后用无菌水冲洗5-6次后接种于培养基中。
实施效果：
接种7天后，统计结果如下：
实施例1：污染率为20.0％；
实施例2：污染率为13.0％；
实施例3：污染率为17.0％；
实施例4：污染率为23.0％；
实施例5：污染率为30.0％；
对比例：污染率为93.5％；
上述结果表明，于对比例相比较，采用本发明的各实施例均可以大幅度地提高组培成功率。