专利名称：含有甘草苷的治疗药物和保健品的制作方法
技术领域：
本发明涉及甘草苷(liquiritin)的用途，尤其涉及在制药领域中的用途。
背景技术：
美国化学文摘(CA 2830762，1934)，已经公开了化合物甘草苷，其结构式为 (甘草苷liquiritin)该化合物其分子式为C21H22O9，无色针状结晶，分子量为418。可由豆科甘草属(Glycgrrhiza)多种植物豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎中提取制得。
发明内容
本发明目的在于提供甘草苷的新用途，即在制药和保健品中的新应用。
实际上，本发明涉及甘草苷作为制备治疗或预防心肌缺血等心血管疾病药物的应用。
为了更好的理解本发明的实质，下面将用甘草苷的药理试验及结果来说明其在制药和保健品领域中的新用途。
采用豆科甘草属(Glycgrrhiza)植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎2000克，粉碎成粗粉，加10倍量乙醇，提取两次，每次3小时。提取液减压回收溶剂，得到的提取物进行柱层析，用乙醇梯度洗脱，收集薄层层析显甘草苷的部分，洗脱液减压回收溶剂，用乙醇重结晶，得到无色粉末甘草苷4克。
将以上提取分离得到的甘草苷，以聚乙二醇6000∶聚乙二醇4000(1∶2-4)混合液作为基质，冷却剂选择二甲基硅油∶液体石蜡(3∶2)，原料甘草苷与基质以1∶4配比，药液温度为60-80℃，以冷却温度为0～5℃，滴口内外径为4.5/7.0mm的滴头，滴口距冷却液面为3-6cm，滴速25-35滴/min的滴制条件，制成每丸含甘草苷10mg的滴丸。
取提取分离得到的甘草苷2g，加注射用水至2000ml，混合均匀后，分装成2mg/2ml/支浓度的注射液装入药瓶中密封，消毒制成产品备用。
1、小鼠急性毒性试验1.1静脉给药小鼠LD50的测定取体重19-20g小鼠50只，雌雄各半，随机分成5组，通过预试验确定最高剂量为100mg/kg，剂量组间距为0.85，以不同浓度，同体积iv给药(甘草苷注射液，2.5mg/ml)一次，体积为10ml/kg。给药后即刻观察动物反应情况，连续观察7天，每日记录小鼠毒性反应及死亡数。死亡小鼠解剖观察主要脏器改变情况，病变脏器做病理组织学检查。用Bliss法计算小鼠半数致死量。结果见表1。
表1 甘草苷注射液静脉注射急性毒性试验
1.2口服给药小鼠LD50的测定取体重20-21g小鼠20只，雌雄各半，小鼠禁食不禁水16h，取0.1g/ml浓度的甘草苷以40ml/Kg的体积灌胃给药，24h内给两次，间隔6h。给药后开始观察动物的毛色、自主活动、呼吸、饮食、体重及死亡情况，连续观察7天。死亡小鼠解剖观察主要脏器改变情况，病变脏器做病理组织学检查。
给药后动物无明显不良反应及死亡，体重增长，精神状态佳，毛色有光泽，大小便正常。表明甘草苷小鼠灌胃给药累积8g/Kg未引起动物明显毒性反应。
以上结果说明一次性静脉注射甘草苷注射液的LD50为73.43mg/Kg，95％可信限为79.83-67.54mg/Kg。小鼠灌胃给药累积8g/Kg未见明显毒性反应。
2、大鼠长期毒性实验实验方法选取80只健康合格大鼠，雌雄各半，随机等分为正常对照组，甘草苷注射液12、6、3mg/kg组，按性别分笼饲养，静脉注射、腹腔注射交替给药，体积均为10ml/kg，对照组给同体积的溶剂，每日1次，连续给药2个月，每周称量记录体重1次，按体重调整给药剂量，同时观察动物外观行为、饮食、活动、排便、皮毛光泽度等情况。于末次给药后24小时，各组均取10只动物，断头处死，取血做血液学及血液生化学检查。解剖大鼠，肉眼观察各组动物主要脏器情况，并取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、甲状腺、胰腺、脑、淋巴结、胃、睾丸、附睾、前列腺、子宫、卵巢称重，并计算脏器系数，同时取上述各器官及垂体、延髓、视神经、十二指肠、回肠、结肠、膀胱、前列腺、胸骨、血管以10％甲醛溶液固定，脱水，石腊包埋，切片，伊红染色后置显微镜下做病理组织组织学检查。剩余大鼠停药，常规饲养二周后，重复上述各项检查，观察毒性反应恢复情况。实验数据采用统计学t检验方法分析处理，比较各组间的差异显著性。
2.1对大鼠一般体征的影响给药大、中、小剂量组与对照组比较，动物的一般体征、外观、饮食、饮水、粪便及活动均无明显异常变化。说明书附
图1、2为甘草苷对大鼠一般体征(进食量、饮水量)影响试验结果图。
2.2、对大鼠体重的影响给药高、中、低剂量组与对照组比较、体重增长趋势、饮食量基本一致。各给药组大鼠体重自给药第3周开始至第9周期间有一定程度的下降，但与对照组比较无显著性差异。各给药组大鼠于停药2周时体重逐渐恢复至正常，结果见表2、表3。
表2 甘草苷注射液对雄性大鼠体重的影响(n＝10，5，g x±SD)
表3 甘草苷注射液对雌性大鼠体重的影响(n＝10，5，g x±SD)
2.3.对大鼠血常规的影响2.3.1、给予甘草苷2个月后对血常规的影响给予甘草苷2个月后，给药高、中、低剂量组大鼠血红蛋白(HB)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、白细胞(WBC)及其分类(分叶细胞GR％和淋巴细胞LY％)、网织红细胞(RC)、凝血时间(CT)等均在正常范围内，各给药组与对照组比较无显著差异，结果见表4。
表4 给药2个月后对大鼠血常规的影响(n＝10，x±SD)
2.3.2、停药2周后对血常规的影响停药2周后，给药组与对照组上述各项血液学检查指标均在正常范围内，各给药组与对照组比较均无显著差异，结果见表5。
表5 停药2周后对大鼠血常规的影响(n＝10，x±SD)
2.4、对血液生化学的影响2.4.1注射给予甘草苷2个月后对血液生化学的影响注射给予甘草苷2个月后，给药高、中、低剂量组与对照组大鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(T-BIL)、肌酐(CRE)、尿素氮(UREA)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(CHOL)、血糖(GLU)均在正常范围内，各给药组与对照组比较无显著差异见表6。
表6 给药2个月后对大鼠血液生化学的影响(n＝10，x±SD)
2.4.2、停药2周后对大鼠血液生化学的影响停药2周后，给药高、中、低剂量组与对照组大鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(T-BIL)、肌酐(CRE)、尿素氮(UREA)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(CHOL)、血糖(GLU)均在正常范围内，各给药组与对照组比较无显著差异，结果见表7。
表7 停药2周后对大鼠血液生化学的影响(n＝10，x±SD)
2.5、对大鼠主要脏器系数的影响
2.5.1甘草苷注射液连续注射2个月后及停药2周后，分别处死动物，解剖大鼠肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、甲状腺、脑、睾丸、附睾、前列腺、子宫(卵巢)等无异常变化，称重，计算脏器系数。结果各主要脏器系数均在正常范围内，给药高、中、低剂量组与对照组的脏器系数比较均无显著差异，结果见表8。
表8 给药2个月后对大鼠主要脏器系数的影响(n＝10，x±SD)
2.5.2、停药2周后对大鼠主要脏器系数的影响停药2周后，解剖大鼠肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、甲状腺、脑、睾丸、附睾、前列腺、子宫(卵巢)等无异常变化，称重，计算脏器系数。结果各主要脏器系数均在正常范围内，给药高、中、低剂量组与对照组的脏器系数比较均无显著差异，结果见表9。
表9 停药2周后对大鼠主要脏器系数的影响(n＝10，x±SD)
2.6、对大鼠主要内脏器官的影响甘草苷注射液连续给药2个月及停药2周后，处死大鼠，解剖，肉眼观察心、肝、脾、肾、肾上腺、胸腺、甲状腺、胰腺、脑、垂体、延髓、视神经、胃、十二指肠、回肠、结肠、淋巴结、膀胱、睾丸、附睾、前列腺、子宫、卵巢、血管、胸骨等未见异常变化。病理切片检查结果个别动物肺脏见有慢性局限性间质炎(对照组1只，高剂量组1只，低剂量组1只)，可能与外界饲养环境有关，非药物作用。送检心、肝、脾、肾、肾上腺、胸腺、甲状腺、胰腺、脑、垂体、延髓、视神经、胃、十二指肠、回肠、结肠、淋巴结、膀胱、睾丸、附睾、前列腺、子宫、卵巢、血管、胸骨组织结构正常，细胞形态均未见明显病理改变。
上述实验结果表明，给大鼠注射甘草苷注射液12、6、3mg/kg，每日1次，静脉注射、腹腔注射交替注射给药，连续给予2个月的长期毒性实验结束后，给药高、中、低剂量组与对照组比较，大鼠一般外观体征、饮食、活动及粪便，体重增长，血象，肝、肾功能及物质代谢，主要脏器系数，心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、胸腺、胰腺、脑、延髓、垂体、胸骨、胃、十二指肠、结肠、膀胱、淋巴结、睾丸、附睾、前列腺、子宫、卵巢的病理切片检查均无明显改变。仅见各给药组大鼠体重自给药第3周开始至第9周期间有一定程度的下降，但与对照组比较无显著性差异，并于停药2周时体重逐渐恢复至正常。个别动物的肺组织炎症改变，分析与药物作用无关。表明甘草苷注射液静脉注射在所给予的剂量无明显毒性，亦无延迟性毒性，大鼠在12mg/kg以下剂量为安全剂量范围内。
3、对心肌缺血的保护和治疗作用3.1对垂体后叶素所致大鼠急性心肌缺血的影响实验前筛选合格大鼠，随机分6组，每组10只，ig甘草苷20、10mg/Kg，20ml/Kg，ip甘草苷20、10mg/Kg，10ml/Kg，ig心得安10mg/Kg，对照组ig同体积生理盐水。连续给药10天，ig末次给药后1h，ip末次给药后0.5h。即将大鼠于清醒状态下固定，尾静脉注射垂体后叶素0.5u/kg(1ml/kg，10秒内注完)，记录注射垂体后叶素后10s、20s、30s、40s、50s、60s、90s心电图，测量给垂体后叶素后T波峰值的变化。结果见表10。
表10 垂体后叶素所致大鼠心电图T波峰值的影响(x±s，n＝10)
与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01结果表明甘草苷在给垂体后叶素60s后开始降低T峰值，与模型组比较差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。
3.2对冠脉结扎大鼠心肌缺血的影响将大鼠随机为假手术组、心肌缺血手术组、甘草苷20、10mg/Kg组。iv(10ml/Kg)给药后，动物乙醚麻醉，经左第4肋间开胸挤出心脏，在左心耳与肺动脉圆锥之间，距主动脉根部2mm处，用手术线结扎冠状动脉前降支，将心脏送回胸腔，排除胸腔内空气，缝合胸壁，假手术组仅做冠脉穿线，不结扎。结扎5h后处死动物，每组取部分心脏，将心室横切4片，置于PH7.4的氯化硝基四氮唑蓝溶液中，于37℃染色10min。分离梗死与正常心肌，分别称重，计算梗死心肌占全心室肌的百分比。取其余大鼠心脏心室肌，精密称重，制成10％匀浆，用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)，用化学发光法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果见表11。
表11 对冠脉结扎大鼠心肌缺血的影响(x±s，n＝8)
结果表明，给甘草苷组大鼠心肌梗死范围与冠脉结扎手术对照组比较明显缩小，心肌SOD活性升高，MDA含量降低，表明甘草苷能减轻心肌缺血的损伤。
3.3对异丙肾上腺素所致小鼠缺氧存活时间的影响小鼠50只，随机等分5组，按表所示剂量灌胃给药，每日一次，连续5日，对照组及模型组给予等体积蒸馏水，体积均为20ml/kg，于末次给药后45min，除对照组和模型组皮下注射生理盐水外，其余各组均皮下注射异丙肾上腺素10mg/kg，将小鼠置于300ml三角烧瓶中，15分钟后加盖密闭，以小鼠呼吸停止作为死亡时间，观察并记录动物存活时间，结果见表12。
表12、对异丙肾上腺素所致小鼠缺氧存活时间的影响(n＝10，X±S)
注与模型组比较*p＜0.05，**p＜0.01由表12结果可见，表明甘草苷对异丙肾上腺素引起的小鼠特异性心肌缺氧有显著的保护作用。
讨论实验研究表明甘草苷能明显改善垂体后叶素所致大鼠心肌缺血心电图，降低T波峰值；缩小冠脉结扎大鼠心肌梗死范围，提高心肌SOD活性，降低心肌脂质过氧化产物MDA含量；增加异丙肾上腺素引起的小鼠特异性心肌缺氧的存活时间。显示甘草苷对心肌缺血有一定的治疗作用。
具体实施例方式
以下将描述本发明的几个实施例，但本发明的内容完全不局限于此。
实施例1采用豆科甘草属(Glycgrrhiza)植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎20千克，粉碎成粗粉，加10倍量乙醇，提取两次，每次3小时。提取液减压回收溶剂，得到的提取物进行柱层析，用乙醇梯度洗脱，收集薄层层析显甘草苷的部分，洗脱液减压回收溶剂，用乙醇重结晶，得到无色粉末甘草苷4克。
以聚乙二醇6000∶聚乙二醇4000(1∶2-4)混合液作为基质，冷却剂选择二甲基硅油∶液体石蜡(3∶2)，原料甘草苷与基质以1∶4配比，药液温度为60-80℃，以冷却温度为0～5℃，滴口内外径为4.5/7.0mm的滴头，滴口距冷却液面为3-6cm，滴速25-35滴/min的滴制条件，制成每丸含甘草苷10mg的滴丸。口服，每次10粒，每日2次。
实施例2取实施例1的方法制备的甘草苷，采取本技术领域公知的输液剂制备方法，制备成甘草苷氯化钠注射液和甘草苷葡萄糖注射液甘草苷20mg，氯化钠2.25g，制成甘草苷氯化钠注射液，其规格为250ml，静脉注射，每次1瓶，每日一次；甘草苷20mg，葡萄糖12.5g，制成甘草苷葡萄糖注射液，其规格为250ml，静脉注射，每次1瓶，每日一次。
实施例3取按实施例1的方法制备的甘草苷2g，加适量的注射用水，用碳酸钠调PH值至7，搅拌溶解，再加相当于甘草苷10-15％量注射用的甘露醇，除菌滤过，测定含量，分装1000支，2mg/支，封口，即得。静脉注射，每次8-16mg，每日一次。
实施例4
取实施例1方法制备的甘草苷100g、10％羟丙甲基纤维素32ml。采取本技术领域公知的胶囊制备方法，制成1000粒胶囊，每粒含甘草苷100mg。口服，每次1粒，每日2次。
实施例5取实施例1方法制备的甘草苷100g、乳糖68g、淀粉60g、滑石粉20g。采取本技术领域公知的片剂制备方法，在适宜容器中混合所有组分，制成颗粒，再加入硬脂酸镁2g，混匀，用9/32时标准凹冲压片，制成1000片，0.25g/片(含甘草苷100mg)。口服，每次1片，每日2次。
权利要求
1.以甘草苷为原料和以甘草苷作为主要活性成分的有效部位为原料，在制备具有抗心肌缺血作用的药物和保健品中的应用。
2.根据权利要求1所述的用途，具有抗心肌缺血作用的药物为治疗或防治心血管疾病的药物和保健品。
全文摘要
本发明涉及以甘草苷(liquiritin)为原料和以甘草苷作为主要活性成分的有效部位为原料，在制药和保健品领域中的新用途。该产品具有抗心肌缺血作用。用于治疗或预防心肌缺血等病人。
文档编号A61P9/10GK101032505SQ20061001677
公开日2007年9月12日 申请日期2006年4月17日 优先权日2006年4月17日
发明者李超生 申请人:李超生, 潘书洋