蛋白酶抑制剂的心肌细胞保护功能及应用的制作方法

专利名称：蛋白酶抑制剂的心肌细胞保护功能及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及Kunitz型蛋白酶抑制剂(KPI/AβPP)，特别是涉及KPI/AβPP的心肌细胞保护功能，及其在生产用于预防和治疗心肌损伤性疾病的药物中的应用。
背景技术：
与牛胰蛋白酶抑制剂相似，来源于人淀粉样β蛋白前体(amyloid β-proteinprecursor，AβPP)的Kunitz型蛋白酶抑制剂区域(Kunitz-type proteinase inhibitordomain，KPI)是一种能够与丝氨酸蛋白酶结合并抑制丝氨酸蛋白酶活性的肽。
作为一种由61个氨基酸组成的多肽，KPI/AβPP分子量相对较小且结构稳定。Kunitz型蛋白酶抑制剂区域(简称KPI或KPI/AβPP)对丝氨酸蛋白酶家族有广泛的抑制作用，可被抑制的蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽释放酶、纤溶酶、弹性蛋白酶和凝血因子VIIa IXa Xa XIa XIIa等(例如参见美国专利6,613,890)。作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂和活性药物成分，KPI/AβPP的基本作用在于将病理性升高的蛋白水解酶活性降低到正常水平，缓解与丝氨酸蛋白酶活性升高有关的临床症状，通常可用于预防和治疗心肺转流术(CPB)后的大出血，CPB诱导的炎性反应以及促进伤口愈合等。
然而，迄今为止尚未见有关KPI/AβPP对心肌细胞的保护功能以及将其用于预防和治疗各种原因导致的急性和慢性心肌性疾病的报道。
发明目的本发明的一个目的是提供KPI/AβPP在生产用于预防和治疗心肌损伤性疾病的药物中的应用。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的KPI/AβPP是以DNA重组技术制备的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的KPI/AβPP是人源的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的心机损伤性疾病选自心肌梗塞、心肌缺血、冠状动脉硬化性心脏病、心肌炎和心肌再灌注性损伤。
本发明的另一个目的是提供一种由KPI/AβPP或其类似物以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物，及其在生产用于保护心肌细胞、预防和治疗心肌损伤性疾病的药物中的应用。


图1显示正常心肌心肌细胞结构基本正常，心肌纤维染色均匀，细胞界限清晰(40×)。
图2显示I/R模型组其中图2a、2b显示心肌细胞水肿，细胞界限不清，胞浆内出现颗粒状物及不规则横带。核碎裂及核消失，漏出性出血。图2c显示心肌细胞呈腊样坏死，炎细胞浸润(40×)。
图3显示小剂量(2.4万KIU/kg)给药组心肌细胞散在灶性坏死，出血，间质水肿，炎性细胞浸润，但间质水肿和细胞浸润程度较I/R模型组略轻(40×)。
图4中剂量(4.8万KIU/kg)给药组部分心肌纤维呈波浪状，肌浆分布不匀，间质无出血和水肿，有数量不等的炎细胞浸润(40×)。
图5大剂量(9.6万KIU/kg)给药组心肌细胞排列相对规整，细胞界限清楚，心肌细胞轻度水肿，肌细胞间只见有散在炎性细胞浸润(40×)。
图6显示hKPI/AβPP对犬急性心梗模型血清酶水平的影响。其中图6a为血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)；图6b为血清肌酸激酶(CK)；6c血清乳酸脱氢酶(LDH)；图6d血清α-羟基丁酸脱氢酶(HBDH)；6e为血清天门冬氨酸氨基转换酶(AST)。
图7显示各组动物心肌梗死发生率水平。
图8显示假手术组动物心肌再灌注损伤的镜下病理改变(40×)。

发明内容
本发明涉及Kunitz型蛋白酶抑制剂(KPI/AβPP)，特别是涉及KPI/AβPP的心肌细胞保护功能，及其在生产用于预防和治疗病理性心肌损伤相关疾病的药物中的应用。本发明进一步涉及由作为基本活性成分的KPI/AβPP及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。
可以利用常规的DNA重组和分子克隆技术制备重组人Kunitz型蛋白酶抑制剂(rhKPI/AβPP)。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的rhKPI/AβPP可以是由原核、真核或酵母表达系统产生的。然而，为了本发明目的，优选的表达系统是巴斯德毕赤酵母表达系统。
以下简单地描述使用优化的发酵培养条件，在80L发酵罐中工业化大规模生产rhKPI/AβPP的方法。
(1)酵母表达载体的构建以人胎盘组织来源的基因组DNA为模板，使用合成的引物15′-CTCTgAATTCAggTCTgCAgTgAACAAgCC-3′和引物25′-gAAgTCTAgATTAAATggCgCTgCCACACAC-3′，经聚合酶链反应(PCR)扩增得到长度约200bp的产物。酶切后与用同种酶消化的pPICZα载体连接，得到重组质粒pPICZα/prekpi。然后，分别合成一段寡核苷酸单链5′-TCgAgAAgAgAgAggTTgTTAgAgAggTCTgCA-3′和5′-gACCTCTCTAACAACCTCTCTCTTC-3′(其中包括编码KPI氨基端四个氨基酸和α因子信号肽切割位点Lys-Arg的密码子)。用PstI和XhoI消化重组质粒pPICZα/prekpi并与退火后的寡核苷酸双链连接，得到重组质粒pPICZα/kpi。酶切分析和测序鉴定表明，pPICZα/kpi，重组质粒携带了预期的α因子信号肽和rhKPI/AβPP基因序列。
(2)重组质粒的转化、阳性克隆的筛选和表达采用电转化法将pPICZα/kpi转化到酵母菌株X-33中。在YPD zeocin阳性培养基中28℃培养36小时后，挑取单克隆菌落接种于BMGY培养基中，待细菌处于对数生长期(OD600＝2～6)时，重悬于BMMY培养基中继续培养。每隔24小时补加100％甲醇至终浓度为0.5％，以诱导rhKPI/AβPP的表达。诱导后，每隔24小时取上清，用胰蛋白酶和底物盐酸苯甲酰-精氨酸-4-硝基酰基苯胺进行活性测定，筛选相对高表达量的菌株。
(3)大规模发酵工艺将高密度的(OD600＝10)酵母工程菌接种于含甘油(5％，V/V)加痕量盐(4.34ml PTM1/L)和生物素(0.08mg/L)的FM21培养基中，在温度28℃、pH3.3、溶解氧浓度20％、搅拌速度600转/分钟，罐内压力12psi条件下，在发酵罐罐内发酵培养30小时。当湿细胞重量＞180～220g/L时，以渐增的速度添加含1.2％PTM1的100％甲醇，诱导rhKPI/AβPP的表达，其甲醇补加速率为3.6ml/小时/L→7.3ml/小时/L→10.9ml/小时/L，直至发酵结束。
(4)表达产物的纯化70L发酵液离心取上清，用NaOH(1mol/L)调pH4.0，添加NaAc-HAc缓冲液(终浓度为20mmol/L)和去离子水稀释后，通过预先用缓冲液A(20mmol/L NaAc-HAc，pH4.0)平衡过的Sepharose SP阳离子交换柱。然后连续加样，检测穿透液的活性，待树脂饱和后用3倍于柱体积的缓冲液A洗柱。用缓冲液B(20mmol/L NaAc-HAc加1mol/L NaCl，pH4.0)洗脱。洗脱液用3000(3K)中空纤维柱除盐和浓缩。
(5)表达产物的活性测定以胰蛋白酶活性抑制方法测定表达产物的活性。将如上纯化的rhKPI/AβPP稀释成不同浓度并与同浓度的胰蛋白酶反应，加入底物(盐酸苯甲酰-精氨酸-4-硝基酰基苯胺)后测定残余的胰蛋白酶量。结果可见，如上得到的rhKPI/AβPP对胰蛋白酶有明显的可逆性抑制作用。
为了深入研究rhKPI/AβPP对犬心肌细胞缺血再灌的保护作用，在本实验中，我们观察了rhKPI/AβPP对活体犬急性心肌梗死动物模型的血清中心肌酶含量及生化指标的影响，同时对各实验组动物的心脏组织进行了病理学观察和统计学分析。在急性心肌梗死动物的实验中发现，与对照组相比，接受rhKPI/AβPP治疗的实验组动物血清心肌酶中的磷酸肌酸激酶(CK)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟基丁酸脱氢酶(HBDH)水平较模型组明显降低且随着用药剂量的加大降低幅度明显。病理学检查结果可见，实验组动物心肌细胞水肿和炎细胞浸润程度较模型对照组明显减轻。
基于这些实验结果，我们初步认定rhKPI/AβPP有可能作为一种新的心肌细胞保护剂，用于预防和治疗急性心肌细胞损伤。
因此，本发明的一个目的是提供KPI/AβPP在生产用于预防和治疗急性心肌梗死的药物中的应用。
根据本发明的一个优选实施方案，本发明的另一个目的是提供一种具有心肌细胞保护活性的基础上由rhKPI/AβPP及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。
用于本发明的rhKPI/AβPP可以是具有天然野生序列的生物学活性多肽，但也可以是为改善产物的生物学活性，或为提高产物的产率或药物动力学性质目的而在基因水平上进行了必要的修饰的rhKPI/AβPP类似物或突变体。这里所说的修饰可以是内部或N末端个别或部分氨基酸的加入、缺失或取代。
本发明涉及的rhKPI/AβPP可以单独使用，也可以作为有各种不同剂型的药物组合物的形式使用。可以使用制药工业领域已知的方法(参见Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.，1980)，以适于口服或非口服给药的单位计量形式制备本发明的药物组合物。例如，可将作为活性成分的有效量的rhKPI/AβPP与医药上可接受的载体或赋形剂均匀地混合，制成溶液或悬浮液形式的适于静脉内、肌肉内、器官腔内、皮内和皮下等胃肠道外途径给药的药物组合物；或者也可以制成片剂、胶囊剂、粉末剂、乳剂、颗粒剂等形式的适于经胃肠道途径给药的药物组合物。
根据本发明的药物组合物，其中所使用的医药上可接受的载体或赋形剂将依据所制备的本发明药物组合物的剂型而有不同的选择。
适于胃肠道外给药的制剂可含有无菌水或盐水、聚乙二醇、油和氢化萘等常用的赋形剂。特别是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作为赋形剂，以控制活性成分的缓慢释放。在其他适于胃肠道外给药的制剂中，还包括含有水杨酸的直肠给药制剂和含有甘胆酸盐的含服给药制剂。
具体地说，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纤维素等赋形剂，淀粉、海藻酸钠、羧甲基纤维素钙和结晶纤维素等崩解剂，硬脂酸镁和滑石等润滑剂，明胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素和羟丙基纤维素等黏结剂，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性剂，以及着色剂、甜味剂、香料、分散剂等辅助成分，以常规方法制备片剂。
可以使用乳糖和甘露醇等赋形剂，淀粉等崩解剂，明胶等黏结剂，以常规方法制备颗粒剂。
或者，可以使用乳糖和蔗糖等赋形剂，以常规方法制备粉末剂。使用明胶、水、蔗糖、阿拉伯胶、山梨醇、甘油、结晶纤维素、硬脂酸镁和滑石等，以常规方法制备胶囊剂。
可以使用水、生理盐水、植物油(如橄榄油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶剂，苯甲酸钠，水杨酸钠和氨基甲酸乙酯等增溶剂，氯化钠和葡萄糖等等渗剂，青霉素和链霉素及其他抗真菌剂等抗生素，苯酚、甲酚、对位羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐剂，抗坏血酸和焦磷酸钠等抗氧化剂，以常规方法制备注射剂。
在任何情况下，所说的可注射制剂均应是无菌和可流动并适于通过注射器注射给药的。另外，在生产、运输和储存条件下，所说的制剂还必须是稳定的，并且能够对抗细菌和真菌等微生物的污染。
另外，也可使用制药工业中已知的方法和辅助成份，将本发明的药物组合物制成微胶囊剂或脂质体包裹剂。
本发明的药物组合物除含有作为基本活性成分rhKPI/AβPP或其类似物或突变体外，还可含有一种或多种合成的、天然的或重组来源的具有协同或辅助作用的其他活性成分。这些活性成分包括但不只限于具有免疫刺激或调节活性、病毒复制抑制活性、功能性心肌细胞修复活性的其他成分，例如可以是干扰素、白介素、胸腺素、心肌细胞生长因子和成纤维细胞生长因子等。
本发明的药物组合物对功能性心肌细胞具有良好的保护作用。虽然有关作用机理目前尚不明确，但我们推测可能与rhKPI/AβPP或其类似物作用于心肌细胞并抑制细胞表面上的丝氨酸蛋白酶类有关。
基于以上的描述，本领域技术人员完全可以理解到，rhKPI/AβPP除具有其固有的蛋白酶抑制活性并因此可用于治疗丝氨酸活性升高相关疾病外，也可以用于预防和治疗病理性心肌细胞损伤及相关疾病。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的rhKPI/AβPP或其类似物通过抑制心肌细胞膜表面的丝氨酸蛋白酶提高心肌细胞的存活性。
一般说来，本发明药物组合物的给药剂量约为0.01-500mg/kg，较好为0.1-100mg/kg。可以以口服、皮下或肌肉注射、腹腔注射、静脉内注射等多种途径药给。当然，本领域技术人员可以理解到，为有效地治疗病人所需的确切的给药剂量，应根据待治疗的病症或病理状态的性质、严重程度、病人的年龄、体重和一般健康状态，所用药物的剂型、病人对所用药物的敏感性和耐受性，以及所使用给药途径等因素，按照个体化的原则由临床医生确定。
具体实施例方式
下列实施例旨在进一步举例说明而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。
下列实施例举例说明rhKPI/AβPP对结扎冠状动脉引起急性心肌梗死犬模型的功能性心肌细胞保护作用。
1、动物(犬)心肌缺血再灌注损伤模型制备用冠状动脉结扎/松弛法复制犬的心肌缺血/再灌注模型。健康杂种犬36只，雌雄兼用，平均体重12～15kg。3％戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉注射麻醉。颈部正中切开，气管插管，连接电动呼吸机于呼气末持续正压呼气(潮气量30ml/Kg，呼吸频率18次/分)，呼∶吸比为2∶1。10分钟后分离股静脉并插管建立输液通路以备给药、抽血。用针形电极插入四肢皮下同步记录标准肢体II导心电图(观察心率和心律)。犬取右侧卧位，经左第四肋开胸，剔除第四肋，暴露心包，在左侧膈神经前1cm处纵向剪开心包，缝制心包床，充分暴露心脏。分离冠状动脉左前降支主干中上1/3处，穿无创结扎线平衡30分钟后，与直径为2mm的硬塑料管一起结扎，于结扎120分钟后抽出硬塑料管，以恢复冠脉血流量，制成心肌缺血再灌注损伤模型。实验过程中以标II导联心电图示波监护(心率及心律)，将棉芯电极(9个)均匀安放于缺血中心区、缺血边缘区及对照区各三点记录心外膜心电。假手术对照组动物模型制备方法同上，但只埋线不结扎冠状动脉。
2、实验动物模型成功标准I/R模型须符合下列要求，方归入分组，否则放弃，冠脉结扎和再灌注模型成功指标结扎成功标志收紧结扎线后结扎线远端心肌颜色发绀，心电图表现为II导和(或)心外膜ST抬高(心外膜心电图ST段抬高≥2mm作为缺血成功的标志)和(或)T高耸与ST段融成单向曲线；再灌注损伤模型成功标志缺血部位心肌颜色恢复，抬高的ST段下降50％以上；用TBC染色发现确有不染色心肌组织。当每组累积达到6个成功模型时实验结束。
3、动物分组、采样和检测将36只犬随机分为6组，每组6只动物。(1)空白对照组即假手术组；(2)模型对照组静脉滴注生理盐水100ml；(3～5)分别为rhKPI/AβPP小、中、大三个不同剂量组分别按2.4万KIU/kg、4.8万KIU/kg、9.6万KIU/kg加入100ml生理盐水中静脉滴注；(6)前列腺素E组10μg/kg加入100ml生理盐水中静脉滴注，于结扎前10分钟开始给药，连续静点160分钟。取缺血前、缺血120分钟及再灌注60分钟，测定血清中肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟基丁酸脱氢酶(HBDH)、天门冬酸氨基转移酶(AST)含量及ST段偏移总电压(mV)数(∑ST)；。然后，处死动物，称取心脏左心室及梗死区重量，测定梗死区/左心室系数的变化；心尖部取4×4×4mm小块心肌，迅速放入冷的10％中性福尔马林固定液中，4℃条件下固定72h。按常规方法制备病理切片并进行HE染色。所得数据的处理用单因素方差分析和Dunnet T检验进行比较。
以下各实施例仅就各项实验的方法学和结果分别进行简要描述。
实施例1rhKPI/AβPP对犬急性心梗模型血清心肌酶的影响酶是由组织细胞合成的，具有特殊催化功能的蛋白质。机体内一种器官或组织可有多种酶，同一种酶又可分布于多种器官，血清酶活性增高可能是多种器官或组织受损的结果。
血清中肌酸激酶(CK)有三种主要的同工酶，即CK-MM，CK-MB，CK-BB。心肌70％为CK-MM。正常人血清中，几乎全是CK-MM，占94-96％。若血清中CK-MB明显增高，提示心肌明显受累。一般认为当血清中CK-MB大于总活性的6％以上为心肌损伤的特异指标。CK-MB是由分子量约为82kd的M亚基和B亚基组成的二聚体，主要存在于心肌细胞中。一般急性心肌梗塞(AMI)患者在心肌损伤3～8小时后CK-MB升高，16～24小时达到高峰。CK-MB可增高10～20倍，是几个酶中升高最早，辐度最大的一个酶。但心机梗塞第三天后基本恢复正常。故CK-MB作为临床急性心肌梗塞(AMI)的早期诊断的重要诊断依据。
LDH是糖的无氧酵解和糖异生的重要酶系之一，广泛存在于心脏、肝脏、肺以及人体各组织内。组织一经损伤，血清LDH即见增高。含H亚基的LDH对作用物的特异性差，除乳酸外，尚可催化α-羟基丁酸脱氢，故临床上又称为α-羟基丁酸脱氢酶(HBDH)。一般认为，计算HBDH/LDH的比值可以帮助诊断肝病或心脏病。HBDH/LDH的比值健康人为0.67，急性心肌梗塞患者超过0.8，HBDH以心肌组织含量最多，约为肝脏的2倍，其活性达总酶活力的一半以上，此酶在发生心肌疾患时明显增高。
天门冬氨酸转移酶(AST)，也称谷草转氨酶，主要分布于心、肝、肾中，有两种同工酶，即胞浆同工酶(s-AST)和线粒体同工酶(m-AST)。正常血清中90％以上为s-AST，AST于急性心机梗塞后4-10小时明显升高，24-48小时达峰值，3-5天后将至基础水平。当细胞膜通透性增大时，s-AST即可入血。而组织严重受损如细胞坏死时，m-AST才被释放入血，所以同工酶测定有利于了解组织损伤程度和预后。
从下表1所示的结果可以看出，与空白对照组相比较，模型对照组动物的血清CK、CK-MB、LDH、HBDH、AST含量水平均明显升高(p＜0.01)。投用rhKPI/AβPP后，可见治疗组动物的CK、CK-MB、LDH、HBDH、AST含量活力水平均显著降低(与模型对照组比较差别有统计学意义p＜0.05或p＜0.01)。
结果参见下列表1和图6。
表1 rhKPI/AβPP对急性心肌梗死犬的保护作用(x±s，n＝6)CK-MB(IU/L)

CK(IU/L)

LDH(IU/L)

AST(IU/L)

HBDH(IU/L)

与I/R组比较*P＜0.05.**P＜0.01用药组间比较与9.6万KIU/Kg组比△P＜0.05，△△P＜0.012.4万KIU/Kg组与4.8万KIU/Kg组及PGE1组@P＜0.05@@P＜0.01实施例2rhKPI/AβPP对犬急性心梗模型心肌梗死面积及重量的影响实验结束后迅速取出动物心脏，用生理盐水冲洗后剔除血管和脂肪等非心肌组织。沿冠状沟切除心房，留心室称重。再顺房室沟从心尖到心底部以0.1cm厚度平行将心室组织切成5片。心肌切片放于0.5％NBT溶液中，37℃孵箱中温浴10分钟。染色后立即冲洗掉多余染料，剪去被染色的非梗死心肌。将未染色的心肌称重，除以心室重即可求得梗死心肌的范围占心室重的百分比。结果如下列表2和图7所示表2 rhKPI/AβPP对心肌梗死面积的影响(x±s，n＝6)

与I/R组比较*P＜0.05，**P＜0.01.用药组间比较与9.6万KIU/Kg组比△P＜0.05，△△P＜0.01，2.4万KIU/Kg组与4.8万KIU/Kg及PGE1组@P＜0.05.
以上结果表明，rhKPI/AβPP可以降低急性心梗的梗死面积及重量，9.6万KIU/Kg组效果优于PGE1组及中、小剂量组，作用效果明显，差异性十分显著。
实施例3rhKPI/AβPP对犬急性心梗模型心律失常的保护作用心律失常评分标准心律失常分析根据Lambeth规则进行。分别全程记录缺血期和再灌注期ECG，观察心率和心律失常发生率。心律失常判断标准如下室性早搏指非连续性的可辨认的期前QRS波；室性心动过速(室速)指连续4个以上的室性早搏；心室纤颤(以下简称室颤)指单个QRS波群无法辨认的紊乱波形；非可逆性室颤指室颤持续10分钟而未能恢复者。参照Curtis和Chen的方法，对心律失常严重程度进行量化分析。具体评分标准为1分0～50个室性早搏，不伴有室或室颤；2分50～500个室性早搏，不伴有室速或室颤；3分＞500个室性早搏，或有1次可逆性室速或室颤；4分2～30次室速或室颤；5分＞30次室速或室颤；6分，出现不可逆性室颤。可见随着用药剂量的增加，心律失常的发生率明显降低。4.8万KIU/Kg组与PGE1组结果相近，9.6万KIU/Kg组效果最好优于4.8万KIU/Kg组与PGE1组，且与4.8万KIU/Kg组比较差异显著(参见表3)。
表3 rhKPI/AβPP对犬缺血和再灌注期心律失常的影响(x±s，n＝6)

与I/R组比较*P＜0.05.**P＜0.01用药组间比较与9.6万KIU/Kg组比△P＜0.05，△△P＜0.012.4万KIU/Kg组与4.8万KIU/Kg组及PGE1组@P＜0.05。
实施例4rhKPI/AβPP对犬急性心梗模型心肌缺血程度(∑ST)的影响通过对动物心外膜心电图的动态观察，发现rhKPI/AβPP可以明显降低动物(犬)心肌缺血过程中的∑ST变化，减少心肌损伤的程度。这一实验观察结果与病理检查结果一致(参见下列表4)。
表4 rhKPI/AβPP对犬急性心肌缺血程度(∑ST)的影响(x±s，n＝6)

本组内与缺血即刻比较*P＜0.05，与I/R组比较□P＜0.05，与2.4万KIU/Kg组比较■P＜0.05，与4.8万KIU/Kg组比较▲P＜0.05；与假手术组比#P＜0.05。
这些结果表明，中、大剂量组rhKPI/AβPP对犬急性心肌损伤具有明显的保护作用，而且保护效果可以与前列腺素组注射液(10μg/kg)相比，特别是9.6万KIU/Kg组在抗心律失常、降低心肌酶水平方面甚至优于前列腺素组。
实施例5rhKPI/AβPP对犬急性心肌梗死模型的心肌细胞病理学改变的影响各组动物心脏组织病理检查结果显示空白对照组所有犬的心脏组织结构均未见任何病理改变(图1)。模型对照组心肌水肿，细胞界限不清，胞浆内出现颗粒状物及不规则横带。核碎裂及核消失，漏出性出血。心肌细胞呈腊样坏死，炎细胞浸润(参见图2)。rhKPI/AβPP小剂量组心肌细胞散在灶性坏死，出血，间质水肿，炎性细胞浸润，但较I/R模型组略轻(参见图3)。rhKPI/AβPP中剂量组部分心肌纤维呈波浪状，肌浆分布不匀，间质无出血，水肿，有数量不等的炎细胞浸，变性程度比模型组明显减轻，炎性细胞浸润更轻(参见图4)。rhKPI/AβPP大剂量组心肌细胞排列相对规整，细胞界限清楚，轻度水肿，偶见散在炎性细胞浸润(参见图5)。
实施例6rhKPI/AβPP对犬缺血再灌注心肌调亡的影响用TUNEL染色检测细胞凋亡，利用犬在体心肌缺血再灌注损伤模型，在末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)的作用下，将地高辛标记的dUTP标记到DNA断端的3′-OH上，进行特异灵敏的原位凋亡的检测，观察rhKPI/AβPP对缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响。TUNEL染色阳性细胞核呈蓝紫色，缺血再灌注(8b)组TUNEL染色阳性细胞数增多，高于假手术组(8a)，而rhKPI/AβPP中大剂量组可降低TUNEL染色的阳性细胞比例(参见图8)。
权利要求
1.Kunitz型蛋白酶抑制剂在生产用于预防和治疗心肌损伤性疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1的应用，其中所说的KPI/AβPP是以DNA重组技术制备的。
3.根据权利要求1的应用，其中所说的KPI/AβPP是人源的。
4.根据权利要求1的应用，其中所说的心肌损伤性疾病选自心肌梗塞、心肌缺血、冠状动脉硬化性心脏病、心肌炎和心肌再灌注性损伤。
5.一种由Kunitz型蛋白酶抑制剂以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物.
全文摘要
本发明涉及Kunitz型蛋白酶抑制剂(KPI/AβPP)，特别是涉及KPI/AβPP的心机细胞保护功能，及其在生产用于预防和治疗心肌损伤性疾病的药物中的应用。
文档编号A61K38/57GK101041072SQ20061001669
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月23日 优先权日2006年3月23日
发明者颜炜群, 王凌燕, 贺巾超, 杨莉莉, 马杰 申请人:吉林圣元科技有限责任公司