专利名称：紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂及其制备方法。
背景技术：
紫杉醇是一种由太平洋紫杉-短叶红豆杉的针叶和树皮中提取的抗微管剂，自从Wani等人在1971年第一次分离并用化学和X射线结晶学方法确定了紫杉醇的结构以来，I期临床研究和II、III期临床试验显示出对人类癌症具有明显的抗瘤作用。这一作用最初是在晚期卵巢和乳腺肿瘤中发现的，已有大量文献报道它对小细胞和非小细胞肺癌、头颈部癌和转移黑素瘤有显著作用。但是，用于临床的主要难点是其化学结构具有高脂性，几乎不溶于水，在水中的溶解度仅为0.25μg mL-1。
目前临床上使用的有代表性的紫杉醇注射剂是将紫杉醇配制成浓缩溶液，即用EL(聚氧乙烯蓖麻油)和无水乙醇(v/v，1∶1)混合液配制成浓度为7mmol L-1的紫杉醇溶液，给药前用0.9％生理盐水或5％葡萄糖液稀释到终浓度为0.35～1.4mmol L-1。这种制剂稀释前可在4℃密封情况下保持较长时间不变质。但是其中所含聚氧乙烯蓖麻油的用量要明显高于配制其它制剂的用量。这种辅料有毒性作用，包括过敏、血管舒张、呼吸困难和低血压。临床试验表明，几乎在每一阶段都会有患者对它表现出强烈的甚至是致命的过敏反应。这些过敏反应主要是聚氧乙烯蓖麻油导致的，紫杉醇本身无致敏性。
所以，研制紫杉醇的新剂型一直是研究者关注的热点。人们探索了多种紫杉醇药物输送系统，如脂质体、乳剂、微囊、微球、纳米胶囊及用环糊精络合等。最近，聚合物键合药的制备和研究受到大家的极大关注。所谓“聚合物键合药”，就是将药物分子用共价键结合到高分子上，制成一定的剂型，采用相应的给药方式，将高分子连同药物送到病人体内，在生理条件下，药物分子从高分子上解离下来，发挥治疗或诊断的作用。药物与高分子键合后可以改善亲油性药物的亲水性，在高分子的保护下，药物可以免受生理环境中酶和免疫系统的攻击，达到缓释和长效的目的。需要特别指出的是，如果两亲性聚合物键合药自组装成胶束，药物一般处于胶束的内核，由于与高分子结合牢固，一般不会通过扩散从胶束中逃逸出来。所以它既具有传统物理包埋胶束的优点，又避免了因动力学上的不稳定造成的药物突释，从而可提高药物的生物利用度和减少药物的毒副作用。
在发明人已经申请的中国专利(中国专利申请号200410011176.3和200610016559.9)中，公开了两种紫杉醇高分子键合药，一是由聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物和紫杉醇键合而成；二是由聚酯酰胺-聚乙二醇-聚酯酰胺三嵌段共聚物和紫杉醇键合而成。在此基础上，利用键合药的两亲性，首先制备它们的胶束水溶液，然后通过冷冻干燥除去水后，得到它们的冻干粉注射剂。
发明内容
本发明的目的之一是提供紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂。
紫杉醇高分子键合药是指通过化学键合的方法将紫杉醇和具有两亲性的可生物降解高分子连接起来的紫杉醇前药，该前药在生理条件下会发生水解反应，释放出紫杉醇，发挥疗效。与紫杉醇键合的高分子是以下两种中的一种一是聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物，二是由聚酯酰胺-聚乙二醇-聚酯酰胺三嵌段共聚物。由于这两种高分子都可生物降解，并且都是两亲性的，与紫杉醇键合后保持生物降解性和两亲性，因而该键合药能在水体系中自组装，形成纳米胶束，容易通过冷冻干燥的方法获得冻干粉。该冻干粉又可以在水中分散溶解，用作注射液。
本发明的目的之二是提供紫杉醇高分子键合药冻干粉注射剂的制备方法，即利用紫杉醇高分子键合药的两亲性，首先使之在水中自组装成胶束，然后冷冻干燥。具体步骤如下(1)制备紫杉醇高分子键合药的胶束水溶液，其步骤是首先用有机溶剂丙酮、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或它们的混合物溶解紫杉醇高分子键合药，有机溶剂体积的毫升数是高分子键合药质量克数的80～150倍；其次是向紫杉醇高分子键合药有机溶液中缓慢加入2～5倍体积的水；最后在室温下旋转蒸发除去有机溶剂。
(2)将上述胶束水溶液离心沉降，离心速度5000～20000转/分，时间5～30分钟，离心结束后倒掉上层清液。
(3)在离心后的胶束水溶液中加入增溶剂乳糖、甘露醇、水解明胶、氯化钠、葡萄糖或它们的混合物，混合均匀；增溶剂用量为胶束水溶液中紫杉醇高分子键合药质量的10～200％。
(4)冷冻干燥除水，制成紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂，其中冻干温度-50～-80℃，时间24～72小时。可以得到紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂。
上述紫杉醇高分子键合药的胶束水溶液的制备方法，是在将有机溶液置换成水溶液的过程中，实现键合药分子的自组装，形成核壳结构的胶束。上述的旋转蒸发方法，适用于挥发性较强的溶剂，如丙酮、四氢呋喃等。
除了旋转蒸发外，还可以采用透析的方法，其步骤和条件为
首先用有机溶剂丙酮、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或它们的混合物溶解紫杉醇高分子键合药，有机溶剂体积的毫升数是高分子键合药质量克数的80～150倍；其次是将紫杉醇高分子键合药有机溶液中转移到截留分子量3500以上醋酸纤维素膜透析袋中，对5～10倍体积的水进行透析，每隔2～4小时更换一次透析液，共透析48～72小时。可以得到紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂。
由于有机溶剂向袋外渗透，水向袋内渗透，袋外的水不断更换，最终实现溶剂的置换和键合药分子的胶束化。显然，透析法适合于挥发性不强的溶剂，如N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜等。
本发明的上述方法，将键合药的有机溶液转化为水溶液，经冷冻干燥，得到可以在水中分散的冻干粉，进而可用注射用水、生理盐水或葡萄糖注射液为溶媒，进行注射或点滴。这种水基注射液和目前临床上使用的以聚氧乙烯/乙醇混合物为溶媒的注射液相比，不再存在由溶媒引起的过敏反应，注射液的稳定性也更好。所制备的冻干粉颗粒的直径在100～150纳米，由于颗粒本身的胶束结构和增溶剂的采用，冻干粉在注射用水中能快速和均匀分散，注射液澄清、透明，黏度低，流动性好，在注射和点滴的操作上同一般水溶性注射液没有明显区别。细胞试验表明(详见实施例1和实施例2)，该冻干粉的水注射液对人的肝癌H7402细胞和大鼠脑胶质瘤C6细胞的杀灭效果同相同剂量的纯的紫杉醇没有明显的区别，因而可望在临床上使用
图1MPEG-PLA-紫杉醇冻干粉对人肝癌细胞的杀灭能力试验结果。详见实施例1。
图2用光散射方法测得的键合药胶束在水溶液中的颗粒大小的分布图，详见实施例2。
图3冻干粉颗粒的电子扫描显微镜照片，详见实施例2。
图4冻干粉在PBS缓冲溶液中紫杉醇的释放曲线，详见实施例2。
图5冻干粉的水溶液对大鼠脑胶质瘤C6细胞的杀灭效果，详见实施例2。
具体实施例方式实施例1制备聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物和紫杉醇键合药(MPEG-PLA-紫杉醇键合药)的冻干粉注射剂。
(1)取0.1g MPEG-PLA-紫杉醇键合药溶解于10ml四氢呋喃中，缓慢加入30ml二次蒸馏水，然后在25℃条件下，用旋转蒸发除去四氢呋喃，得到MPEG-PLA-紫杉醇键合药的胶束水溶液。
(2)将上述胶束水溶液离心分离，离心的速度为12000转/分，离心20分钟后，弃去上层清液，在剩余的水溶液中加入0.1g的乳糖，然后在—50℃条件下，真空干燥至恒重，得到MPEG-PLA-紫杉醇键合药的冻干粉注射剂。
图1给出了该冻干粉的水溶液对人的肝癌H7042细胞的杀灭效果。细胞培养基为DMEM培养基，加入了10％小牛血清，2.0mM的谷酰胺，100U/ml的盘尼西林和100μg/ml链霉素。细胞悬液的起始密度为5×104个/ml，在96孔板的每孔内加入150μl细胞悬液，在含5％CO2的加湿的培养箱中37℃培养4小时，然后加入计量的冻干粉溶液，再培养56小时。用MTT法检测存活细胞的比例。以纯的紫杉醇和不带紫杉醇的嵌段共聚物为参比。如图1所示，20ng/ml的紫杉醇键合药对H7402癌细胞有明显的杀灭效果。
实施例2制备聚酯酰胺-聚乙二醇-聚酯酰胺三嵌段共聚物和紫杉醇键合药(紫杉醇/P(LA-GA)-PEG-P(LA-GA)/紫杉醇键合药)的冻干粉注射剂。
(1)取0.2g紫杉醇/P(LA-GA)-PEG-P(LA-GA)/紫杉醇键合药溶解于22ml N，N-二甲基甲酰胺中，然后转入透析袋(截留分子量7500)中，置入100ml二次蒸馏水，每隔2h换水一次，透析48小时，透析袋中即为紫杉醇/P(LA-GA)-PEG-P(LA-GA)/紫杉醇键合药的胶束水溶液。
(2)将上述胶束水溶液离心沉降，离心的速度为18000转/分，离心8分钟后，弃去上层清液，在剩余的水溶液中加入0.25g的甘露醇，然后在-60℃条件下，真空干燥至恒重，得到紫杉醇/P(LA-GA)-PEG-P(LA-GA)/紫杉醇键合药的冻干粉注射剂。
图2是用光散射方法测得的键合药胶束在水溶液中的颗粒大小的分布图，测得的平均直径为119nm。
图3是冻干粉颗粒的电子扫描显微镜照片。可见颗粒的大小基本均匀，在50-100nm范围。
图4给出了该冻干粉在PBS缓冲溶液中紫杉醇的释放曲线。可见紫杉醇的释放是比较平缓的，没有初期的突释现象，释放速度受溶液pH值的影响，pH值越低，释放越快。
图5给出了该冻干粉的水溶液对大鼠脑胶质瘤C6细胞(RBG-6)的杀灭效果。细胞培养基为RPMI-1640培养基，加入了10％小牛血清，100U/ml的盘尼西林和100μg/ml链霉素。细胞悬液的起始密度为5×103个/ml，在96孔板的每孔内加入180μl细胞悬液，在含5％CO2的加湿的培养箱中37℃培养24小时，然后加入计量的冻干粉溶液，再培养72小时。用MTT法检测存活细胞的比例。以纯的紫杉醇和不带紫杉醇的嵌段共聚物为参比。如图5所示，40ng/ml的紫杉醇键合药对RBG-6癌细胞具有明显的杀灭效果。
实施例3制备聚酯酰胺-聚乙二醇-聚酯酰胺三嵌段共聚物和紫杉醇键合药(紫杉醇/P(LA-GA)-PEG-P(LA-GA)/紫杉醇键合药)的冻干粉注射剂。
(1)取0.2g紫杉醇/P(LA-GA)-PEG-P(LA-GA)/紫杉醇键合药溶解于15ml二甲基亚砜中，然后转入透析袋(截留分子量5000)中，置入150ml二次蒸馏水中，第一天每隔2h换水一次，第二天后每隔4h换水一次。经过72小时透析，得到紫杉醇/P(LA-GA)-PEG-P(LA-GA)/紫杉醇键合药的胶束水溶液。
(2)将上述胶束水溶液离心沉降，离心的速度为15000转/分，离心15分钟后，弃去上层清液，在剩余的水溶液中加入0.2g葡萄糖，然后在-80℃条件下，真空干燥至恒重，得到紫杉醇/P(LA-GA)-PEG-P(LA-GA)/紫杉醇键合药的冻干粉注射剂。
实施例4聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物和紫杉醇键合药(紫杉醇-PEG-PLA-紫杉醇键合药)的冻干粉注射剂。
(1)取0.15g紫杉醇-PEG-PLA-紫杉醇键合药溶解于12ml丙酮中，缓慢加入50ml二次蒸馏水，然后在25℃条件下，用旋转蒸发除去丙酮，得到紫杉醇-PEG-PLA-紫杉醇键合药的胶束水溶液。
(2)将上述胶束水溶液离心沉降，离心的速度为8000转/分，离心30分钟后，弃去上层清液，在剩余的水溶液中加入0.1g NaCl，然后在-80℃条件下，真空干燥至恒重，得到紫杉醇/P(LA-GA)-PEG-P(LA-GA)/紫杉醇键合药的冻干粉注射剂。
实施例5制备聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物和紫杉醇键合药(MPEG-PLA-紫杉醇键合药)的冻干粉注射剂。
步骤和条件同实施例1，使用的增溶剂为甘露醇和水解明胶质量比1∶1的混合物，它们的总质量与MPEG-PLA-紫杉醇键合药质量的比为0.6。
实施例6制备聚酯酰胺-聚乙二醇-聚酯酰胺三嵌段共聚物和紫杉醇键合药(紫杉醇/P(LA-GA)-PEG-P(LA-GA)/紫杉醇键合药)的冻干粉注射剂。
步骤同实施例2，键合药的用量为0.15g，使用的有机溶剂四氢呋喃和N，N-二甲基甲酰胺的体积比1∶1的混合物，其总体积为18ml，增溶剂为甘露醇和乳糖质量比1∶1的混合物，它们的总质量与MPEG-PLA-紫杉醇键合药质量的比为0.4。
权利要求
1.紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂，其特征在于，所述的紫杉醇高分子键合药是指通过化学键合将紫杉醇和具有两亲性的可生物降解高分子材料连接起来的紫杉醇前药。
2.如权利要求1所述的紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂，其特征在于，所述的具有两亲性的可生物降解高分子材料为聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物。
3.如权利要求1所述的紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂，其特征在于，所述的具有两亲性的可生物降解高分子材料为聚酯酰胺-聚乙二醇-聚酯酰胺三嵌段共聚物。
4如权利要求1所述紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂的制备方法，其步骤如下(1)制备紫杉醇高分子键合药的胶束水溶液，其步骤和条件为首先用有机溶剂丙酮、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或它们的混合物溶解紫杉醇高分子键合药，有机溶剂体积的毫升数是高分子键合药质量克数的80～150倍，其次是向紫杉醇高分子键合药有机溶液中缓慢加入2～5倍体积的水，最后在室温下通过旋转蒸发除去有机溶剂；(2)将上述胶束水溶液离心沉降，离心速度5000～20000转/分，时间5～30分钟，离心结束后倒掉上层清液；(3)在离心后的胶束水溶液中加入增溶剂乳糖、甘露醇、水解明胶、氯化钠、葡萄糖或它们的混合物，混合均匀；增溶剂用量为胶束水溶液中紫杉醇高分子键合药质量的10～200％；(4)冷冻干燥除水，制成紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂，冻干温度为-50～-80℃，时间24～72小时，得到所述紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂。
5.权利要求1所述紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂的制备方法，其特征在于，采用透析的方法制备紫杉醇高分子键合药的胶束水溶液，其步骤和条件为首先用有机溶剂丙酮、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或它们的混合物溶解紫杉醇高分子键合药，有机溶剂体积的毫升数是高分子键合药质量克数的80～150倍；其次是将紫杉醇高分子键合药有机溶液中转移到截留分子量3500以上醋酸纤维素膜透析袋中，用5～10倍体积的水进行透析，每隔2～4小时更换一次透析液，共透析48～72小时，得到所述紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂。
全文摘要
本发明提供了紫杉醇高分子键合药的冻干粉注射剂及其制备方法。该冻干粉注射剂以键合了紫杉醇的可生物降解的两亲性高分子为原料，先用溶剂取代的方法，制备两亲性高分子－紫杉醇键合药的胶束水溶液，再经过冷冻干燥脱水而成。所得到的冻干粉在注射用水中能够迅速分散溶解，溶于水性介质后可直接注射，不存在目前临床应用的紫杉醇－聚氧乙烯蓖麻油－乙醇注射剂的过敏问题。
文档编号A61K9/19GK1850276SQ20061001661
公开日2006年10月25日 申请日期2006年3月3日 优先权日2006年3月3日
发明者景遐斌, 李汉蕴, 谢志刚, 陈学思, 徐效义, 庄秀丽 申请人:中国科学院长春应用化学研究所