一种吸烟引起树鼩多器官纤维化模型的建立方法与流程

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种吸烟引起树鼩多器官纤维化模型的建立方法。

背景技术：

烟草流行是世界迄今所面临的最大公共健康威胁之一。尼古丁是烟草中含量最多，毒性最大的化学成分。尼古丁能通过改变纤维母细胞的功能调节纤维化。香烟烟雾通过呼吸道到达小气道和肺泡时被迅速吸收进入体内血液循环，然后通过循环系统分散到全身各个器官，作用于尼古丁受体细胞，改变其生理过程。每个组织器官的纤维化形成与自身器官功能和器官特异性上皮细胞的微环境有关，具有自身独特的特征。纤维化发生是一个渐进性的过程：烟草中的有害物质刺激组织器官使其上皮细胞或内皮屏障损伤，促使成纤维细胞的细胞外基质产生细胞活化；活化的细胞外基质产生细胞发生结构和表型的改变，产生大量细胞外基质。同时胞内的促分裂素原活化蛋白激酶和核转录因子通路被激活，促进产生大量的细胞因子。通过旁分泌，介导包括巨噬细胞在内的炎症细胞向受刺激部位移动。t细胞被激活，分泌促纤维化生长因子，如白细胞介素和肿瘤坏死因子α等。巨噬细胞促进纤维原细胞增殖与分化，同时分泌包括转化生长因子β和il-1在内的多种细胞因子。损伤因素持续存在，造成反复损伤。成纤维细胞继续被激活，产生更多的细胞外基质。细胞因子持续不断的引起组织炎症和胶原过度表达，细胞外基质不断沉积，组织器官纤维化逐渐形成，最终造成脏器功能丧失。在损伤-炎症-修复的三期过程中，任何一项或多项过程的失调，均可造成纤维化的发生。炎症能导致各种细胞因子分泌失调，生理性愈合转变为病理性纤维化。

目前的研究强调用小鼠模型来定义香烟烟雾暴露的由细胞，分子和病理学结果，且运用吸烟动物模型来预测治疗吸烟疾病新疗法的疗效。虽然啮齿类动物有以下优点：(1)研究者对鼠类生物习性相对熟悉；(2)价格相对低廉、体积小和繁殖周期快；(3)可使用许多近交系及其突变体并应用相关酶抗体和基因探针；(4)其基因序列和人类基因同源性很高，且在免疫相关实验中可以操纵它们的基因表达。但是，啮齿类动物和人类必然存在解剖和生理上的差异。豚鼠也作为吸烟模型动物被使用，但是研究其的研究通路所需的试剂很难找到。而非灵长类动物吸烟动物模型有以下优点：(1)在遗传、解剖、组织学和生理学上与人类有更大的相似性；(2)在吸烟条件下，非灵长类动物呼吸道的病理学变化与啮齿类动物相比更明显；(3)与啮齿类动物相比，可对非灵长类动物使用支气管镜和肺功能检查；(4)非灵长类吸烟模型的肺组织样本的生物指标可用于人类吸烟者疾病的早期检查。但非灵长类动物吸烟动物模型其研究成本昂贵。目前有必要寻找更好的能概括人类吸烟器官生理和病理变化的动物模型。因此迫切需要探寻更可靠更有效的新物种来构建吸烟动物模型，帮助我们更好的进行研究。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种吸烟引起树鼩多器官纤维化模型的建立方法。本发明通过对树鼩进行香烟烟雾处理，诱导树鼩多器官纤维化。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种吸烟引起树鼩多器官纤维化模型的建立方法，包括以下步骤：

(1)将野生树鼩驯化三个月后，在不通风的房间内，让树鼩在自然呼吸状态下吸收香烟烟雾，每天两次，每次30分钟，每周6天，暴露时间为9个月；所述香烟烟雾是燃烧烟叶产生的烟雾，烟叶的使用量为每立方米空间使用100g烟叶；

(2)用masson染色评价树鼩吸烟引起多器官肺纤维化动物模型。

本发明与现有技术相比具有如下突出的优点及有益效果：

(1)树鼩有许多有价值的特性，具有作为生物医学研究实验动物的潜能，在遗传、解剖、生物学上与人类有相似之处。

(2)本发明方法成功地建立了树鼩多器官纤维化模型，操作过程简单，易重复，可以有效解决啮齿类动物模型在组织解剖结构上与人类差异显著的问题，同时也可以避免使用非灵长类动物模型的高成本投入；这将对今后研究吸烟引起器官纤维化发病机制和治疗药物提供良好的模型基础。

附图说明

图1为肺组织masson染色量化图。

图2为心组织masson染色量化图。

图3为肝组织masson染色量化图。

图4为肾组织masson染色量化图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明实施方式不限于此。

实施例1：

具体造模流程和检测方法如下：

(1)动物分组：将24只野生树鼩驯化三个月后随机分成两组，实验组18只，对照组6只。

(2)香烟烟雾造模：实验组暴露于燃烧烟叶不通风的房间30分钟，让树鼩在自然呼吸状态下吸收香烟烟雾，一天两次，每周6天，暴露时间长达9个月；所述香烟烟雾是燃烧烟叶产生的烟雾，烟叶的使用量为每立方米空间使用100g烟叶；对照组暴露于空气。分别于3月、6月、9月处死树鼩，观察肺、心、肝、肾组织变化。

(3)饲养条件：成年的中国树鼩从中国科学院昆明动物研究所获得。所有动物饲养在笼子里(320厘米×180厘米×160厘米)，在实验开始前饲养三个月以适应环境。饲养环境保持在恒定的温度(20-25℃)、湿度(40-60％)、12h光照和12h黑暗、充足的水和食物。

(4)动物处死及标本制作：腹腔注射戊巴比妥钠处死树鼩，开胸取肺、心、肝、肾组织，置于福尔马林中浸泡，进行组织病理检测。

实施例2：

对树鼩肺、心、肝、肾组织进行纤维化程度检测：

(1)肺纤维化程度：采用masson染色方法观察肺组织纤维化程度。

(2)心纤维化程度：采用masson染色方法观察心组织纤维化程度。

(3)肝纤维化程度：采用masson染色方法观察肝组织纤维化程度。

(4)肾纤维化程度：采用masson染色方法观察肾组织纤维化程度。

实施例3：

造模结果评定：

(1)肺纤维程度变化：masson染色显示实验组气管、血管周围、肺泡间隔纤维蛋白的数量增加，如图1所示。

(2)心纤维程度变化：masson染色显示实验组心肌细胞间隙和血管周围纤维蛋白的数量增加，如图2所示。

(3)肝纤维程度变化：masson染色显示实验组窦周和血管周围纤维蛋白的数量增加，如图3所示。

(4)肾纤维程度变化：masson染色显示实验组肾小球周围纤维蛋白的数量增加，如图4所示。

18只树鼩按本发明方法建立肺纤维化模型，全部成功，说明本方法可以有效建立树鼩肺纤维化模型，可重复性高。

综上，本发明方法可成功建立树鼩纤维化模型，操作过程简单，易重复，可以用于啮齿类动物模型无法完成的生物技术新药的评价，同时也可以避免使用非灵长类动物模型的高成本投入。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

技术总结
本发明属于生物技术领域，公开了一种吸烟引起树鼩多器官纤维化模型的建立方法。该方法是将野生树鼩驯化三个月后，在不通风的房间内，让树鼩在自然呼吸状态下吸收香烟烟雾，每天两次，每次30分钟，每周6天，暴露时间为9个月；所述香烟烟雾是燃烧100g烟叶产生的烟雾；用Masson染色评价树鼩吸烟引起多器官肺纤维化动物模型。本发明方法成功地建立了树鼩多器官纤维化模型，操作过程简单，易重复，可以有效解决啮齿类动物模型在组织解剖结构上与人类差异显著的问题。这将对今后研究吸烟引起器官纤维化发病机制和治疗药物提供良好的模型基础。

技术研发人员：杨世华;吴绮琪;黄群山
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2017.03.30
技术公布日：2017.08.04