一种耐碱性猕猴桃种质资源的鉴定方法与流程

本发明涉及农业技术领域中的果树种质资源的鉴定方法，尤其涉及一种耐碱性猕猴桃种质资源的鉴定方法。

背景技术：

猕猴桃是原产我国的重要果树资源，因其富含维生素c、叶酸和膳食纤维而备受人们喜爱。我国猕猴桃的年均产量占世界市场出口份额的一半以上，其中四川、陕西、河南和贵州4个省份的猕猴桃产量占国内产量的90％以上，但果实的综合品质、单位产量和价格与新西兰、智利等发达国家相比，还有不小差距，原因之一是我国缺乏适应性强和高抗性的专用砧木。目前我国猕猴桃生产中砧木选用随机，造成接穗品种的果实外观和内在品质不均匀，影响了市场竞争力。由于猕猴桃喜欢酸性土壤，根系分布浅且为肉质根，所以我国适宜猕猴桃种植的国土面积有限，北方大部分地区的土壤都偏碱，ph值普遍在8.0左右，非常不利于猕猴桃的生长，碱性土壤会造成猕猴桃叶片黄化，营养不良和树势衰弱。国内对于耐碱性猕猴桃种质资源的筛选和鉴定研究很少，也还没有可靠的鉴定标准和方法，缺乏抗性砧木培育的必备抗性材料。因此，急需建立一套行之有效的耐碱性猕猴桃种质资源的鉴定方法，并以此为基础，培育耐碱性专用砧木，提高接穗品种的果实综合品质，提升我国在猕猴桃国际贸易中的市场竞争力。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种耐碱性猕猴桃种质资源的鉴定方法。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种耐碱性猕猴桃种质资源的鉴定方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种耐碱性猕猴桃种质资源的鉴定方法。本发明操作简便，节省时间和空间，鉴定结果可靠，利用本发明可以快速筛选和鉴定耐碱性猕猴桃资源，为培育耐碱性专用砧木提供抗性材料。所述耐碱性鉴定方法包括如下步骤：

(1)猕猴桃资源的组织培养；

(2)组培苗的继代培养；

(3)组培苗的碱害模拟处理；

(4)碱害指数(alkalidamageindex，adi)的统计分析；

(5)耐碱性鉴定。

优选地，步骤(1)中猕猴桃资源的组织培养方法为：挑选前一年休眠的猕猴桃枝条，剪取适当长度，根据芽点分布情况，切成约40cm长度，保证每个枝条切段上带有2～3个芽点，浸泡在水中，加入0.5％的吐温-20，用毛刷将表面灰尘洗去(注意不要伤及芽点)，并用蒸馏水清洗3-5遍，将枝条切段的三分之一浸入水中，并保持水深，6～8周后，芽点处会有新芽长出，将新芽和茎段切下(长度2～3cm)，浸泡在75％酒精中30s，之后用25％(体积分数)市售消毒剂(5％次氯酸钠)清洗消毒20min，无菌水冲洗5遍，并用灭菌的刀片将切口处切掉2～3mm，将带芽茎段放于出芽培养基，调整培养基ph值进行培养。

其中，出芽培养基为：ms+0.5mg/l6-苄基腺嘌呤(6-ba)+1.0mg/l吲哚乙酸(iba)。

其中，出芽培养基ph值是5.8。

其中，出芽培养基培养条件为24±2℃，相对湿度40％，16小时光照，8小时黑暗。

优选地，步骤(2)中，猕猴桃组培苗的继代培养方法为：在出芽培养基中培养3～4周后，茎段上新生出的腋芽长至2厘米时，切下转入增殖培养基，大约1个月后将新长出的嫩芽转入新的增殖培养基中实现组培苗的继代培养，大约每隔1个月更换一次增殖培养基，配方：ms+1.0mg/l玉米素或ms+1.0mg/l玉米素+0.5mg/l赤霉素，培养条件为24±2℃，相对湿度40％，16小时光照，8小时黑暗。

其中，增值培养基ph值是5.8。

优选地，步骤(3)中组培苗的碱害模拟处理方法为：

调整碱害模拟所需的培养基的ph值为8.0～8.5，高温高压灭菌，挑选具有3～4片小叶、高度1.5～2cm的生长基本一致的各猕猴桃资源的组培苗，接入培养基中，每个处理每份资源接苗10瓶，每瓶3棵，共计30棵组培苗。

其中，培养基配方为：ms+0.5mg/l6-ba+1.0mg/liba，通过氢氧化钠(naoh)和盐酸(hcl)调整培养基的ph值到8.0～8.5。

优选地，步骤(4)中碱害指数(alkalidamageindex，adi)的统计分析方法为：胁迫处理30天后，根据组培苗所表现出来的受害症状进行统计分析。

碱害指数(adi)的分级标准如下：

ⅰ小苗正常生长，无受害症状；

ⅱ叶片边缘有轻度发黄或干枯，面积少于1/3；

ⅲ叶片边缘及中部发黄或干枯，面积大于1/3，嫩梢有干枯症状，还伴有水渍状玻璃化现象；

ⅳ叶片或茎段完全干枯，嫩梢发黄或干枯，生长受到抑制，植株矮化。

依据下列公式计算各猕猴桃资源的碱害指数：adi＝∑(x×n)/(4n)×100

x--各级碱害级数

n--各级碱害级数对应的植株数

n--调查的总植株数。

优选地，步骤(5)中耐碱性鉴定依据为adi值：值越大，表明碱害越严重；值越小，表明碱害越轻。碱害指数25≤adi＜40为耐碱性资源；40≤adi＜50为中度耐碱性资源；adi≥50为不耐碱性资源。

本发明的主要优点是：1使用氢氧化钠调整培养基的ph值模拟碱性生长环境，在培养基中添加氢氧化钠调整到固定的ph值，直接作用于组培苗，效果更直接，由于每个培养基的ph值都是固定的，因此可以保证根际微环境ph值的均匀一致，使得后续的表型鉴定更直观，数据统计更便利；2鉴定耐碱性猕猴桃资源时所用的材料为组培苗，可以保证鉴定材料生长的一致性；3并制定了相应的碱害指数分级标准及碱害指数计算方法。

猕猴桃是多年生雌雄异株、异花授粉果树，雌株授粉不均匀会导致种子质量的差异，实生后代又会出现性状的分离，枝条会因树龄及位置(近轴端或远轴端)的不同而出现生长情况的差异，因此，如果直接使用枝条或实生后代进行抗性鉴定，会导致鉴定结果的不稳定。组织培养不但可以保持猕猴桃资源的稳定性和一致性，还可以保持其优异性状。因此在组织培养条件下进行猕猴桃资源耐碱性鉴定，可以保证材料的均一性，通过调整培养基ph值模拟碱害处理，在处理30天后依据碱害指数进行资源评价，确保鉴定结果的稳定和可靠。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的碱害指数分级标准示意图

具体实施方式

实施例

本实施例以采集的三份野生猕猴桃资源kw-1、kw-2和kw-3为例。

一种耐碱性猕猴桃种质资源的鉴定方法，所述耐碱性鉴定方法包括如下步骤：

1)kw-1、kw-2和kw-3的组织培养；

2)组培苗的继代培养；

3)组培苗的碱害模拟处理；

4)碱害指数的统计分析；

5)耐碱性鉴定。

步骤1)中猕猴桃资源的组织培养方法为：挑选前一年嫁接于资源圃的休眠枝条，剪取适当长度带回组培准备室，根据芽点分布情况，切成约40cm长度，保证每个枝条切段上带有2个芽点，浸泡在水中，加入0.5％的吐温-20，用毛刷将表面灰尘洗去，不要伤及芽点，并用蒸馏水清洗3～5遍，将枝条切段的三分之一浸入水中，并保持水深，约6～8周后，芽点处会有新芽长出，将新芽和茎段切下(长度约2～3cm)，浸泡在75％酒精中30s，之后用25％(体积分数)市售消毒剂(5％次氯酸钠)清洗消毒20min，无菌水冲洗5遍，并用灭菌的刀片将切口处切掉约2～3mm，将带芽茎段放于出芽培养基：ms+0.5mg/l6-ba(6-苄基腺嘌呤)+1.0mg/liba(吲哚乙酸)，调整培养基ph值5.8。培养条件为：24±1℃，相对湿度40％，16小时光照，8小时黑暗。

步骤2)中三种猕猴桃组培苗的继代培养方法为：大约在出芽培养基中培养3～4周后，茎段上新生出的腋芽长至2厘米时，切下转入增殖培养基，kw-1和kw-2的增殖培养基为：ms+1.0mg/lzt(玉米素)+0.5mg/lga3(赤霉素)，调整培养基ph值为5.8，kw-3的增殖培养基为：ms+1.0mg/lzt(玉米素)+0.5mg/lga3，调整培养基ph值为5.8。大约1个月后将新长出的嫩芽转入新的增殖培养基中实现组培苗的继代培养，大约每隔1个月更换一次增殖培养基；

步骤3)中组培苗的碱害模拟处理方法为：

通过氢氧化钠和盐酸调整培养基的ph值为8.0，高温高压灭菌，挑选具有3～4片小叶、高度约1.5～2cm的生长基本一致的各猕猴桃资源的组培苗，接入培养基中，每个处理每份资源接苗10瓶，每瓶3棵，共计30棵组培苗。

步骤4)中碱害指数的统计分析方法为：碱害胁迫30天后，根据组培苗所表现出来的受害症状进行统计分析，

碱害指数的分级标准如下：

ⅰ小苗正常生长，无受害症状；

ⅱ叶片边缘有轻度发黄或干枯，面积少于1/3；

ⅲ叶片边缘及中部发黄或干枯，面积大于1/3，嫩梢有干枯症状，还伴有水渍状玻璃化现象；

ⅳ叶片或茎段完全干枯，嫩梢发黄或干枯，生长受到抑制，植株矮化。

依据下列公式计算各猕猴桃资源的碱害指数：adi＝∑(x×n)/(4n)×100

x--各级碱害级数

n--各级碱害级数对应的植株数

n--调查的总植株数

步骤5)中耐碱性鉴定的依据为adi值：值越大，表明碱害越严重；值越小，表明碱害越轻。碱害指数25≤adi＜40为耐碱性资源；40≤adi＜50为中度耐碱性资源；adi≥50为不耐碱性资源。

如图1所示，随着碱害指数的增加，叶片的生长发育正常程度显著下降。

根据碱害指数对kw-1、kw-2和kw-3进行耐碱性鉴定，kw-1每级的株数分别为20、9、1、0，碱害指数为34.17；kw-2分别为8、7、2、13，碱害指数为66.67；kw-3分别为13、11、4、2，碱害指数为45.83；因此kw-1为耐碱性资源，kw-2为不耐碱性资源，kw-3为中度耐碱性资源。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。