粪便菌群移植技术及其应用的制作方法

本发明涉及一种粪便菌群移植技术及其在仔猪养殖中的应用。
背景技术：
：仔猪消化系统和免疫系统发育不完善，容易因营养因素、环境应激、感染细菌病毒等引发腹泻。仔猪腹泻无论在散养户，还是规模化、集约化养猪场均普遍存在。腹泻可导致仔猪生长缓慢、体质变弱，甚至死亡，给猪场造成严重的经济损失。目前针对仔猪腹泻的治疗方法主要是使用抗生素，但长期使用抗生素容易产生耐药性，造成病程延长，治疗费用增加，导致其他并发症等。动物的胃肠道中栖居着大量微生物，其数量高达10万亿个，1000多种。在长期进化过程中，肠道菌群与宿主形成了互惠共生的关系，它不仅随宿主生长而变化，还影响宿主健康。肠道菌群凭借其强大的代谢和调控能力，又被称为“超级生物体”。当肠道菌群紊乱时，不仅会使胃肠道机能受损，也会影响动物机体各方面功能。作为机体不可或缺的一部分，肠道菌群被认为更像是宿主的一个重要器官。大量研究表明，动物腹泻时，肠道菌群失调，有益菌急剧降低，有害菌急剧增多。且抗生素可造成肠道菌群严重失调，导致腹泻治愈率降低。粪便菌群移植是将健康个体粪便中的功能菌群，移植到受体胃肠道内，重建具有正常功能的菌群，达到治疗疾病的目的。国内外研究表明粪便菌群移植对难辨梭状芽孢杆菌感染、溃疡性结肠炎、克罗恩病等，有明显疗效。粪菌移植在治疗人类患者肠道疾病时，粪便主要采集于健康亲属或无血缘关系的健康者，是在同种人不同个体之间进行粪菌移植。目前，还未见运用粪便菌群移植方法用于仔猪养殖的报道。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种粪便菌群移植技术及其在仔猪养殖中的应用。为了解决上述技术问题，本发明提供一种粪便菌群移植方法，包括以下步骤：1)、粪便的采集及筛选条件：采集猪的新鲜粪便(备用)，被采集新鲜粪便的猪需同时满足以下两个条件：a)、至采集日为止的2-3个月内没有发生腹泻且没有使用抗生素；b)、采集日经粪便检测无以下疾病的病原：猪瘟、猪圆环病毒2型感染、蓝耳病、伪狂犬、猪丹毒、猪支原体肺炎、口蹄疫等；2)、粪菌悬液的制备：先将无菌生理盐水与甘油混合，得甘油水混液；所述甘油水混液中甘油的体积浓度为8％～15％；然后按照1g:10～50ml的料液比，将所采集的新鲜粪便加入甘油水混液中，均匀搅拌后形成悬浮液，所述悬浮液静置0.5～5min，取上清，所述上清为粪菌悬液；将粪菌悬液直接用于下述步骤3)，或者将粪菌悬液分装于无菌离心管，-80℃保存；3)、粪便菌群移植：将新鲜配制的粪菌悬液或者解冻后的冻存粪菌悬液对三元或二元杂交受体仔猪进行粪便菌群移植；所述粪便菌群移植方式为：口灌服、灌肠、或者借助鼻胃管、内窥镜等插入上消化道。灌服时，一般为新生仔猪于1～20天(例如为1～12d、1～15d、7～20d)隔天灌服1～3ml的粪菌悬液。生理盐水即0.85％(质量％)的氯化钠水溶液。冻存时间至少为1个月，一般为半年。作为本发明的粪便菌群移植方法的改进：猪的品种为金华猪、藏猪、香猪、梅山猪。本发明还同时提供了上述粪便菌群移植方法的用途：用于仔猪养殖，改善仔猪肠道形态，降低腹泻，缓解断奶应激，从而提高其生长性能。本发明可通过调节和恢复受体仔猪肠道菌群结构和多样性，改善肠道形态，提高仔猪对疾病的抵抗力，减少仔猪腹泻，降低断奶、气候变化等应激，从而提高其生长性能。在本发明中，供体粪菌是采集于我国的本地猪种，而受体则是不同品种的外三元仔猪，用于改善其肠道功能，提高抵抗各种应激能力(尤其是抗断奶应激)和抗病力，从而提高生长性能，养殖过程中可减少抗生素等药物使用，提高畜产品安全性。本发明具有如下技术优势：1.本发明使用的粪菌来源于我国地方猪种，容易取得，成本低，且制备后可冻存于超低温冰箱长期使用。2.粪菌移植操作简便，可在仔猪阶段多次使用，从而减少饲用或治疗用抗生素的使用。3.粪菌移植无毒副作用，使用后可使仔猪皮毛光滑，生长状况改善。4.金华猪、梅山猪、藏猪、香猪等为我国优良地方猪种，具有抗病力强、耐粗饲、适应性强、肉品质好、繁殖率高等特点，是粪菌移植的优选供体。5.受体猪可以为任何品种的仔猪或生长猪。综上所述，本发明主要采用经严格筛选的我国健康地方猪种的新鲜粪便，经分离、制备，得到粪菌悬液，进行菌群移植，可调节和恢复受体仔猪肠道菌群结构和多样性，改善肠道形态，提高仔猪对疾病的抵抗力，减少仔猪腹泻，降低断奶、气候变化等应激，从而提高其生长性能。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1是实施例2对照组(未接受粪菌移植仔猪)空肠绒毛扫描电镜图。图2是实施例2试验组(接受粪菌移植仔猪)空肠绒毛扫描电镜图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。实施例1、一种粪便菌群移植方法，依次进行以下步骤：1)、粪便的采集与筛选条件：采集我国地方猪种金华猪的新鲜粪便备用，对供体猪的筛选条件为：(1)至采集日为止的2-3个月内未发生腹泻且未使用抗生素(任何抗生素)。(2)采集日经粪便检测无猪瘟、猪圆环病毒2型感染、蓝耳病、伪狂犬、猪丹毒、猪支原体肺炎、口蹄疫等疾病的病原。2)、粪菌悬液的制备(1)先将无菌生理盐水与甘油混合，得甘油水混液；该甘油水混液中甘油的体积浓度为8％；取步骤1)所得的新鲜粪便，以1g:10ml加入甘油水混液均匀搅拌后形成悬浮液，悬浮液静置0.5min，取上清，该上清为粪菌悬液；(2)取粪菌悬液分装于无菌离心管。3)、粪便菌群的移植将新鲜制备的粪菌悬液，通过经口灌服方法，对受体仔猪进行粪便菌群移植。选择胎次相同且同日出生的“长×大”二元杂交新生仔猪12窝，随机分成2组(每组6窝)。试验组新生仔猪分别于1～12d隔天灌服1ml的金华猪粪便菌悬液，对照组灌服等量无菌生理盐水，饲养管理按常规进行，试验期20天(断奶前一天)。试验结束后，分别从各组随机选取6头(每窝1头)，共12头猪进行屠宰试验。屠宰前自由饮水，禁食12h，宰前称重。饲养试验结果表明：与对照组相比，试验组仔猪平均日增重提高11.9％(p<0.05)，腹泻率降低46.9％(p<0.05)，绒毛高度/隐窝深度比值提高8.2％(p<0.05)。实施例2、一种粪便菌群移植方法，依次进行以下步骤：1)、粪便的采集与筛选条件：采集我国地方猪种广西香猪新鲜粪便备用，对供体猪的筛选条件为：(1)至采集日为止的2-3个月内未发生腹泻且未使用抗生素(任何抗生素)。(2)采集日经粪便检测无猪瘟、猪圆环病毒2型感染、蓝耳病、伪狂犬、猪丹毒、猪支原体肺炎、口蹄疫等疾病的病原。2)、粪菌悬液的制备(1)先将无菌生理盐水与甘油混合，得甘油水混液；该甘油水混液中甘油的体积浓度为10％；取步骤1)所得的新鲜粪便，以1g:30ml加入甘油水混液均匀搅拌后形成悬浮液，悬浮液静置3min，取上清，该上清为粪菌悬液；(2)取粪菌悬液分装于无菌离心管，-80℃保存。3.粪便菌群的移植将冻存1月的粪菌悬液经解冻至常温，通过经口灌服方法，对受体仔猪进行粪便菌群移植。相同且同日出生的“杜×长×加”三元杂交新生仔猪12窝，随机分成2组(每组6个重复)。试验组新生仔猪分别于1～15d隔天灌服2ml的广西香猪粪便菌悬液，对照组灌服等量无菌生理盐水，饲养管理按常规进行，试验期27天(断奶前一天)。试验结束后，分别从各组随机选取6头(每个重复1头)，共12头猪进行屠宰试验。屠宰前自由饮水，禁食12h，宰前称重。饲养试验结果表明：与对照组相比，试验组仔猪日增重均提高14.5％(p<0.05)，腹泻率降低56.2％(p<0.05)，绒毛高度/隐窝深度比值提高12.0％(p<0.05)，从图1、图2扫描电镜图可看出，粪菌移植显著改善了受体仔猪肠绒毛形态。实施例3、一种粪便菌群移植方法，依次进行以下步骤：1)、粪便的采集与筛选条件：采集我国地方猪种西藏藏猪新鲜粪便备用，对供体猪的筛选条件为：(1)至采集日为止的2-3个月内未发生腹泻且未使用抗生素(任何抗生素)。(2)采集日经粪便检测无猪瘟、猪圆环病毒2型感染、蓝耳病、伪狂犬、猪丹毒、猪支原体肺炎、口蹄疫等疾病的病原。2)、粪菌悬液的制备(1)先将无菌生理盐水与甘油混合，得甘油水混液；该甘油水混液中甘油的体积浓度为15％；取步骤1)所得的新鲜粪便，以1g:50ml加入甘油水混液均匀搅拌后形成悬浮液，悬浮液静置5min，取上清，该上清为粪菌悬液；(2)取粪菌悬液分装于无菌离心管，-80℃保存。3)、粪便菌群的移植：将冻存半年的粪菌悬液经解冻至常温，通过经口灌服方法，对受体仔猪进行粪便菌群移植。选择胎次相同且同日出生的“杜×长×大”三元杂交新生仔猪12窝，随机分成2组(每组6个重复)。试验组新生仔猪分别于7～20d隔天灌服3ml的西藏藏猪粪便菌悬液，对照组灌服等量无菌生理盐水，饲养管理按常规进行，试验期27天(断奶前一天)。粪菌移植结束后，分别从各组随机选取6头(每个重复1头)，共12头猪进行屠宰试验。屠宰前自由饮水，禁食12h，宰前称重。饲养试验结果表明：与对照组相比，试验组仔猪日增重均提高9.9％(p<0.05)，腹泻率降低34.4％(p<0.05)，绒毛高度/隐窝深度比值提高8.5％(p<0.05)。对比例1-1，将实施例1中的“甘油体积浓度为8％的甘油水混液”改成“无菌生理盐水”，即取消10％甘油的使用；其余等同于实施例1。对比例1-2，将实施例1中的“甘油体积浓度为8％的甘油水混液”改成“甘油体积浓度为20％的甘油水混液”，其余等同于实施例1。对比例1-3，将实施例1中的“甘油水混液”改成“人类粪菌提取制备时用的磷酸盐缓冲液”，其余等同于实施例1。对比例1-1～对比例1-3相对于对照组的实验结果如下表1所示：表1对比例2，将实施例2中的“无菌生理盐水”改成“蒸馏水”，其余等同于实施例2。其相对于对照组的实验结果如下表2所示：表2日增重增加腹泻率下降绒毛高度/隐窝深度比值提高实施例214.5％56.2％12.0％对比例22.2％3.9％4.6％对比例3，将实施例3中的“悬浮液静置5min”改成“悬浮液静置10min”，其余等同于实施例3。其相对于对照组的实验结果如下表3所示：表3日增重增加腹泻率下降绒毛高度/隐窝深度比值提高实施例39.9％34.4％8.5％对比例34.5％3.2％4.9％对比例4，将实施例2中的“以1g:30ml加入甘油水混液均匀搅拌后形成悬浮液”改成“以1g:100ml加入甘油水混液均匀搅拌后形成悬浮液”，其余等同于实施例2。其相对于对照组的实验结果如下表4所示：表4日增重增加腹泻率下降绒毛高度/隐窝深度比值提高实施例214.5％56.2％12.0％对比例45.1％4.3％3.9％最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页12