本发明涉及植物组织培养
技术领域：
，尤指一种钩藤的培育方法。
背景技术：
：钩藤是常用的中药材之一，始载于梁代陶弘景的《名医别录》，药用历史悠久。钩藤性味甘、凉，具有清热平肝，息风定惊之功效，其主要化学成分为钩藤碱和异钩藤碱。临床上广泛用于头痛、高血压、惊痫抽搐、神经衰弱等症。钩藤为钩藤片、正天丸、天麻钩藤颗粒、脉君安等多个著名中药品种的主要原料药和中药配方的常用药。不良作息习惯导致高血压、高血脂和高血糖人群数量不断增加，人们对天然植物药的需求日益增加。据不完全统计，仅钩藤每年的需求量即高达10000多吨，其中出口到日本、韩国等国家达4000多吨。钩藤生长时对于生长地的含水量以及环境湿度有较高的要求，含水量过剩或环境湿度太大会导致其根部或茎部腐坏，甚至死亡。而旋转喷淋的方式覆盖范围小，不适合给钩藤类的灌木浇水；滴罐则需要在地面上铺设复杂多路管道，占用钩藤的生长地，且难以维持钩藤生长需要的湿度；采用传统的从地面用水管灌入的浇水方式，耗水量大、浇水量不均匀、耗时长，易导致部分钩藤因吸水过多而至根部腐坏，此种情况通常会施加防治根腐病的药剂，得到的钩藤并非纯天然、绿色环保的钩藤，为钩藤入药增加风险。事实上，现有的通过分株、扦插、种子等方式并结合传统浇水方式进行栽培获得的钩藤的产量及药用成分偏低，已无法满足递增的需求量。因此，提供一种纯天然、产量高、药用成分含量高的钩藤的培育方法十分必要。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供一种钩藤的培育方法，其通过生物技术手段和化学方法，对钩藤进行多倍体诱导，建立钩藤多倍体诱导体系，诱导率高，并结合特有的浇水方式培育的钩藤植株，其药用成分含量增加，产量多。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种钩藤的培育方法，包括以下步骤：步骤一、将钩藤种子依次经浸泡、消毒后转移至种子培养基中培养20～25d，得到无菌幼苗胚轴；步骤二、从无菌幼苗胚轴上切取长度为0.4～0.8cm的不含子叶节的胚轴外植体，将胚轴外植体平放在第一愈伤组织培养基中进行暗培养，20～25d后，胚轴外植体的两端膨大即形成胚轴愈伤组织，然后将胚轴愈伤组织转移至第二愈伤组织培养基中进行暗培养7～20d，得到新鲜愈伤组织；步骤三、将新鲜愈伤组织转移到分化培养基中进行分化培养20～25d，得到丛芽；步骤四、将丛芽转接到壮苗培养基中进行壮苗培养，当单株幼苗长度为3～4cm时，在茎基部切断，转移到生根培养基中进行生根培养，20～25d后，长出长1.5～2.0cm的根，得到钩藤幼苗。优选的是，所述种子培养基为不含激素的ms培养基；所述第一愈伤组织培养基包括ms、1.0～1.5mg/l的tdz、0.03～0.05mg/l的naa；所述第二愈伤组织培养基包括ms、1.0～1.5mg/l的tdz、0.03～0.05mg/l的naa、80～200mg/l的秋水仙素；所述分化培养基包括ms、0.1～0.4％的活性炭；所述壮苗培养基包括ms、1.0～1.5mg/l的6-ba、0.1～0.2mg/l的naa；所述生根培养基包括1/2ms、0.5～0.8mg/l的iba、0.2～0.5mg/l的naa、0.2％的活性炭。优选的是，步骤一中浸泡的具体方法为：将选择好的钩藤种子装在小布袋中，置于转速为200rpm的摇床上浸泡4h；消毒的具体方法为：将浸泡好的钩藤种子置于超净工作台上，用10％的次氯酸钠消毒8～10min，然后用无菌水清洗4～6次。优选的是，步骤四中所述分化培养基还包括2.0mg/l的6-ba、0.1mg/l的naa。优选的是，各个步骤的培养温度均为20～25℃。优选的是，还包括：步骤五、将钩藤幼苗移栽至苗棚内培育，具体为：a、对苗棚内的土地进行烘烤，然后深翻土地直至土壤细柔、无粘块，撒入牲畜粪便，并加入腐殖质土，调节ph为6.5～8.0，然后铺设厚度为5cm的砂质土，并按照宽度为2m的规格设置两排畦，两排畦之间设有宽为20cm的排水沟；b、控制苗棚内温度为23℃，按照每株钩藤幼苗占用20×20cm的土地面积进行移栽，移栽完成后，淋浇定根水，所述定根水包括7～10重量份的维生素c、4～6重量份的油菜素内酯、3～6重量份的吲哚乙酸、2～7重量份的赤霉素、5～9重量份的亚硒酸钠、4～7重量份的钼酸钠、3～5份复合氨基酸、0.4～0.9份的大蒜硒多糖、6～11重量份的蛋醋液、100重量份的水混合而成；c、之后，每隔4天浇水一次，每隔2天通风一次，控制苗棚内相对湿度为80％～85％。优选的是，步骤b与步骤c中，淋浇定根水及浇水时均使用浇水系统，所述浇水系统设置在所述苗棚内，所述浇水系统包括两根输水管、n个滑道以及2n个浇水组件，所述两根输水管水平平行横置在所述苗棚内的上方，且均垂直于所述畦的宽度方向，每根输水管上沿管长方向等间距设有n个出水孔，所述n个滑道等间距水平平行架设在所述两根输水管之间，每个滑道均与所述两根输水管垂直，一个滑道的两个端部均对应所述两根输水管各自的一个出水孔，一个滑道上设置两个浇水组件，所述浇水组件包括与滑道滑动连接的一个滑块、与滑块固定连接一个电动伸缩杆以及一根浇水管，浇水管的一端与滑道的其中一个端部对应的出水孔密封连通、另一端为与电动伸缩杆的自由端连接的具有长条形喷淋端的喷头；浇水时，一个滑道内的两个滑块分别带动各自的浇水管滑动至其中一排畦的两侧，电动伸缩杆伸长使喷头靠近钩藤植株，喷头与苗棚内地面的距离为15～20cm，任意两个相邻滑道之间的间距等于所述喷头的长条形喷淋端的长度。本发明至少能达到以下有益效果：1.本发明使用多倍体诱导的方法获得钩藤幼苗，诱导过程使用的设备、药品和材料较简单；因在无菌条件下进行，不受季节和植物生长周期影响，技术稳定。诱导效率高、选择余地大。因秋水仙素对愈伤组织进行诱导，有同时诱导出四倍体或八倍体的可能，选育的余地较大。缩短新品种选育的周期。较田间常规采用浸渍法、涂抹法、棉花球滴浸法等诱导和选育的方法节约3年以上的时间，为满足人们的用药需求奠定基础。2.本发明将经过多倍体诱导获得的钩藤幼苗移入苗棚内培育，苗棚内配合钩藤幼苗形成的畦搭设浇水系统，浇水系统中的浇水管可通过滑块在滑道内移动来定位浇水位置，且浇水时通过电动伸缩杆调整喷头与地面的距离，使喷头喷出的水能够准确射入钩藤生长地，并且喷头的喷淋端的长度与滑道的间距相互配合，确保浇水量均匀，确保钩藤生长的水量和湿度，根腐病患病率降低，最终获得的钩藤产量高、药用成分含量高。此外，本发明提出的技术方案具有简便易行、可操作性和重现性好的特点。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本发明所述的浇水系统的结构示意图。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，术语“横向”、“纵向”、“轴向”、“径向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。<实施例1>步骤一、选择成熟、饱满的钩藤种子依次经浸泡、消毒后转移至种子培养基中培养20～25d，得到无菌幼苗胚轴，所述种子培养基为不含激素的ms培养基；步骤二、从无菌幼苗胚轴上切取长度为0.4cm的不含子叶节的胚轴外植体，将胚轴外植体平放在第一愈伤组织培养基中进行暗培养，20d后，胚轴外植体的两端膨大即形成胚轴愈伤组织，然后将胚轴愈伤组织转移至第二愈伤组织培养基中进行暗培养20d，得到新鲜愈伤组织，所述第一愈伤组织培养基包括ms、1.0mg/l的tdz、0.03mg/l的naa，所述第二愈伤组织培养基包括ms、1.0mg/l的tdz、0.03mg/l的naa、80mg/l的秋水仙素；步骤三、将新鲜愈伤组织转移到分化培养基中进行分化培养20d，得到丛芽，所述分化培养基包括ms、0.1％的活性炭；步骤四、将丛芽转接到壮苗培养基中进行壮苗培养，当单株幼苗长度为3～4cm时，在茎基部切断，转移到生根培养基中进行生根培养，20d后，长出长1.5～2.0cm的根，得到钩藤幼苗，所述壮苗培养基包括ms、1.0mg/l的6-ba、0.1mg/l的naa，所述生根培养基包括1/2ms、0.5mg/l的iba、0.5mg/l的naa、0.2％的活性炭。步骤一中浸泡的具体方法为：将选择好的钩藤种子装在小布袋中，置于转速为200rpm的摇床上浸泡4h；消毒的具体方法为：将浸泡好的钩藤种子置于超净工作台上，用10％的次氯酸钠消毒8～10min，然后用无菌水清洗4～6次。各个步骤的培养温度均为20～25℃。<实施例2>步骤一、选择成熟、饱满的钩藤种子依次经浸泡、消毒后转移至第一培养基中培养20～25d，得到无菌幼苗胚轴，所述种子培养基为不含激素的ms培养基；步骤二、从无菌幼苗胚轴上切取长度为0.6cm的不含子叶节的胚轴外植体，将胚轴外植体平放在第一愈伤组织培养基中进行暗培养，23d后，胚轴外植体的两端膨大即形成胚轴愈伤组织，然后将胚轴愈伤组织转移至第二愈伤组织培养基中进行暗培养15d，得到新鲜愈伤组织，所述第一愈伤组织培养基包括ms、1.2mg/l的tdz、0.04mg/l的naa，所述第二愈伤组织培养基包括ms、1.2mg/l的tdz、0.04mg/l的naa、150mg/l的秋水仙素；步骤三、将新鲜愈伤组织转移到分化培养基中进行分化培养23d，得到丛芽，所述分化培养基包括ms、0.3％的活性炭、2.0mg/l的6-ba、0.1mg/l的naa。步骤四、将丛芽转接到壮苗培养基中进行壮苗培养，当单株幼苗长度为3～4cm时，在茎基部切断，转移到生根培养基中进行生根培养，23d后，长出长1.5～2.0cm的根，得到钩藤幼苗，所述壮苗培养基包括ms、1.3mg/l的6-ba、0.2mg/l的naa，所述生根培养基包括1/2ms、0.6mg/l的iba、0.4mg/l的naa、0.2％的活性炭。步骤一中浸泡的具体方法为：将选择好的钩藤种子装在小布袋中，置于转速为200rpm的摇床上浸泡4h；消毒的具体方法为：将浸泡好的钩藤种子置于超净工作台上，用10％的次氯酸钠消毒8～10min，然后用无菌水清洗4～6次。各个步骤的培养温度均为23℃。<实施例3>步骤一、选择成熟、饱满的钩藤种子依次经浸泡、消毒后转移至第一培养基中培养20～25d，得到无菌幼苗胚轴，所述种子培养基为不含激素的ms培养基；步骤二、从无菌幼苗胚轴上切取长度为0.8cm的不含子叶节的胚轴外植体，将胚轴外植体平放在第一愈伤组织培养基中进行暗培养，25d后，胚轴外植体的两端膨大即形成胚轴愈伤组织，然后将胚轴愈伤组织转移至第二愈伤组织培养基中进行暗培养7d，得到新鲜愈伤组织，所述第一愈伤组织培养基包括ms、1.5mg/l的tdz、0.05mg/l的naa，所述第二愈伤组织培养基包括ms、1.5mg/l的tdz、0.05mg/l的naa、200mg/l的秋水仙素；步骤三、将新鲜愈伤组织转移到分化培养基中进行分化培养25d，得到丛芽，所述分化培养基包括ms、0.4％的活性炭；步骤四、将丛芽转接到壮苗培养基中进行壮苗培养，当单株幼苗长度为3～4cm时，在茎基部切断，转移到生根培养基中进行生根培养，25d后，长出长1.5～2.0cm的根，得到钩藤幼苗，所述壮苗培养基包括ms、1.5mg/l的6-ba、0.2mg/l的naa，所述生根培养基包括1/2ms、0.8mg/l的iba、0.5mg/l的naa、0.2％的活性炭。步骤一中浸泡的具体方法为：将选择好的钩藤种子装在小布袋中，置于转速为200rpm的摇床上浸泡4h；消毒的具体方法为：将浸泡好的钩藤种子置于超净工作台上，用10％的次氯酸钠消毒8～10min，然后用无菌水清洗4～6次。各个步骤的培养温度均为25℃。将实施例1-3培育的钩藤幼苗在生根培养基中继续培养7d，然后分别从实施例1-3中随机抽取单株钩藤幼苗，在无菌状态下剪取嫩叶分别制备10个样品，并设置对照组，对照组为浸渍法培育的钩藤幼苗，浸渍法具体方法为：先将钩藤种子浸种催芽,待其胚根露白时，把钩藤种子浸在0.5％的秋水仙素溶液中24h，取出洗脱秋水仙素，然后播种得到的钩藤幼苗，剪取幼苗嫩叶也制备10个样品。然后，使用流式细胞仪进行多倍体检测，根据上述操作共进行三次测试，三次测试结果计算平均值，结果见表1。其中，流式细胞仪检测的主要药剂和样品处理方法：(1)药剂wpb解离液：0.2mol/ltris-hc1，4mmol/lmgc12·6h2o，2mmol/ledta·na2·2h2o，86mmol/lnacl，10mmol/l焦亚硫酸钠，1％pvp-10，1％(tritonx-100，ph7.5，4℃下保存。荧光探针：碘化丙啶(pi)，配制成1mg/ml溶液，4℃下保存。(2)样品处理方法分别采取钩藤幼苗的新鲜嫩叶片，去主脉，切取2cm2，放入预冷的培养皿里，加入预冷的wpb解离液2ml，用锋利的刀片一次性快速切碎，然后，吸取wpb解离液，用400目滤膜过滤，收集滤液置于4℃冰箱中孵育5min，再在4℃下控制转速为1000r/min离心5min。弃去上清液，加入200μl预冷的wpb解离液，同时加入300μl预冷的pi染料，混匀后置于4℃的冰箱中，避光，静置染色30min，最后移到上样管进行检测。此外，通过spss统计学软件的duncan多重比较方法，对实施例1-3的诱导率分别和对照组的诱导率进行显著性差异检验，结果如表1所示，不同大写字母(a、b)表示在0.01显著性水平差异极显著。表1多倍体诱导率检测结果多倍体诱导率(％)0.01显著水平检验实施例148.26a实施例249.96a实施例346.26a对照组8.23b通过spss统计学软件对每处理10个样品，并进行3次测试分别得到的多倍体诱导率的标准误差，实施例1的标准误差为1.92，其多倍体诱导率为(48±1.92)％，实施例2的标准误差为1.58，其多倍体诱导率为(49.96±1.58)％，实施例3的标准误差为1.27，其多倍体诱导率为(46.26±1.27)％，对照组的标准误差为2.02，其多倍体诱导率为(8.23±2.02)％，实施例1的多倍体的诱导率是对照组的5.86倍，实施例2的多倍体的诱导率是对照组的6.07倍，实施例3的多倍体的诱导率是对照组的5.62倍。且经显著性检验，三个实施例与对照组的差异极显著。因此，通过本发明的多倍体诱导的方法获得的钩藤幼苗诱导效率高、选择余地大。<实施例4>步骤一、选择成熟、饱满的钩藤种子依次经浸泡、消毒后转移至第一培养基中培养20～25d，得到无菌幼苗胚轴，所述种子培养基为不含激素的ms培养基；步骤二、从无菌幼苗胚轴上切取长度为0.6cm的不含子叶节的胚轴外植体，将胚轴外植体平放在第一愈伤组织培养基中进行暗培养，23d后，胚轴外植体的两端膨大即形成胚轴愈伤组织，然后将胚轴愈伤组织转移至第二愈伤组织培养基中进行暗培养15d，得到新鲜愈伤组织，所述第一愈伤组织培养基包括ms、1.2mg/l的tdz、0.04mg/l的naa，所述第二愈伤组织培养基包括ms、1.2mg/l的tdz、0.04mg/l的naa、150mg/l的秋水仙素；步骤三、将新鲜愈伤组织转移到分化培养基中进行分化培养23d，得到丛芽，所述分化培养基包括ms、0.3％的活性炭、2.0mg/l的6-ba、0.1mg/l的naa。步骤四、将丛芽转接到壮苗培养基中进行壮苗培养，当单株幼苗长度为3～4cm时，在茎基部切断，转移到生根培养基中进行生根培养，23d后，长出长1.5～2.0cm的根，得到钩藤幼苗，所述壮苗培养基包括ms、1.3mg/l的6-ba、0.2mg/l的naa，所述生根培养基包括1/2ms、0.6mg/l的iba、0.4mg/l的naa、0.2％的活性炭。步骤五、取步骤四获得的钩藤幼苗的叶片，通过流式细胞仪进行多倍体检测，筛选并保留是多倍体的钩藤幼苗，即钩藤多倍体幼苗，利用步骤四的壮苗培养基和生根培养基对钩藤多倍体幼苗进行扩繁。扩繁的数量根据需要而定。步骤六、将扩繁后的钩藤多倍体幼苗移栽至苗棚内培育，具体为：a、对苗棚内的土地进行烘烤，然后深翻土地直至土壤细柔、无粘块，撒入牲畜粪便，并加入腐殖质土，调节ph为6.5～8.0，然后铺设厚度为5cm的砂质土，并按照宽度为2m的规格设置两排畦，两排畦之间设有宽为20cm的排水沟；b、控制苗棚内温度为23℃，按照每株钩藤多倍体幼苗占用20×20cm的土地面积进行移栽，移栽完成后，淋浇定根水，所述定根水包括7～10重量份的维生素c、4～6重量份的油菜素内酯、3～6重量份的吲哚乙酸、2～7重量份的赤霉素、5～9重量份的亚硒酸钠、4～7重量份的钼酸钠、3～5份复合氨基酸、0.4～0.9份的大蒜硒多糖、6～11重量份的蛋醋液、100重量份的水混合而成；c、之后，每隔4天浇水一次，每隔2天通风一次，控制苗棚内相对湿度为80％～85％。步骤b与步骤c中，淋浇定根水及浇水时均使用浇水系统，如图1所示，所述浇水系统设置在所述苗棚内，所述浇水系统包括两根输水管11、n个滑道12以及2n个浇水组件，所述两根输水管11水平平行横置在所述苗棚内的上方，且均垂直于所述畦10的宽度方向，每根输水管11上沿管长方向等间距设有n个出水孔111，所述n个滑道12等间距水平平行架设在所述两根输水管11之间，每个滑道12均与所述两根输水管11垂直，一个滑道12的两个端部均对应所述两根输水管11各自的一个出水孔111，一个滑道12上设置两个浇水组件，所述浇水组件包括与滑道滑动连接的一个滑块131、与滑块131固定连接一个电动伸缩杆132以及一根浇水管133，浇水管133的一端与滑道12的其中一个端部对应的出水孔111密封连通、另一端为与电动伸缩杆132的自由端连接的具有长条形喷淋端的喷头134；浇水时，一个滑道12内的两个滑块131分别带动各自的浇水管133滑动至其中一排畦10的两侧，电动伸缩杆132伸长使喷头134靠近钩藤植株，喷头134与苗棚内地面的距离为15～20cm，任意两个相邻滑道12之间的间距等于所述喷头134的长条形喷淋端的长度。实际使用中，浇水管133的长度足够滑块131带动其在滑道12内移动，为防止浇水管由于重力而悬掉在半空中，可在滑道上套设多个活动环，浇水管134穿过活动环后分别与出水孔111和喷头134连接。步骤一中浸泡的具体方法为：将选择好的钩藤种子装在小布袋中，置于转速为200rpm的摇床上浸泡4h；消毒的具体方法为：将浸泡好的钩藤种子置于超净工作台上，用10％的次氯酸钠消毒8～10min，然后用无菌水清洗4～6次。各个步骤的培养温度均为23℃。<对比例>采用常规方法种植的钩藤幼苗，在大棚内进行后续培养，采用传统的水管直接灌入浇水，每隔4天浇水一次，每隔2天通风一次，控制大棚内相对湿度为80％～85％。对比例与实施例4中的钩藤的种植面积以及种植密度相同。钩藤收获后，统计各自的钩枝产量，并分别从实施例4和对比例中随机选择收获的钩藤各十株，晒干后磨成粉，各取2.0g，通过高效液相色谱法测定药用成分(钩藤碱以及异钩藤碱)的含量，结果如下表2所示。表2钩藤产量及其药用成分含量亩产量(kg)钩藤碱含量(％)异钩藤碱含量(％)根腐病发病率(％)实施例4484.60.0320.00657.3对比例317.00.0150.003718.6从表2可以看出，本发明实施例4中通过多倍体诱导形成钩藤幼苗，后期在苗棚内按畦栽培，并采用特有的浇水系统，配合合理的浇水通风方式，最终得到的钩藤植株产量提高了34.7％52.87％，钩藤中钩藤碱及异钩藤碱的含量均有提高，根腐病的发病率明显下降。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。当前第1页12