一种通过芍药子叶诱导愈伤组织再生不定芽的方法与流程

本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及一种通过芍药子叶诱导愈伤组织再生不定芽的方法。

背景技术：

芍药（paeonialactiflora）为芍药科芍药属多年生宿根花卉，具有观赏及药用价值，是中国的传统名花，栽培历史悠久，素有“花相”之称，是园林造景常用植物。

目前，芍药的新品种培育工作多采用人工定向授粉、人工诱变和自然突变等传统育种方法，但是芍药的一些品种存在雄蕊瓣化或无雄蕊的问题，而且自然杂交授粉结实率低，种属间的生殖隔离等因素限制了传统育种方法的应用。这些原因使芍药传统育种时间长、选择效率低、更新速度慢，造成芍药育种现状难以满足日益增长的花卉市场的需求。组织培养技术是目前常用的高效繁殖手段，而近年来转基因技术的快速发展，对于芍药的品种改良更加有利。依赖芍药组织培养技术建立再生系统，实现芍药基因的遗传转化，从而改变芍药的生物学特性，为芍药寻求一条高产、稳定的繁殖道路是国内外学者的共同研究目标。

在大多数植物中，叶片是公认的诱导愈伤组织最佳材料，而子叶是植物发育时的第一片叶，贮藏大量的养分，细胞分裂活跃。前人对芍药的愈伤组织诱导、增殖、分化均有不同程度的研究成果，但是大部分研究止于愈伤组织增殖，少部分研究虽有不定芽的分化，但都是以露地自然生长的外植体为材料，外植体存在污染难以控制的问题，前期的消毒处理浪费大量的人力物力，并且还受季节的影响，不能周年进行研究，制约了芍药的快速育种和更新速度，此外愈伤组织分化周期长，容易褐化，不定芽分化率仅为10%-20%，并且芽长势较弱。

技术实现要素：

为了弥补上述现有技术的不足，本发明提供了一种通过芍药子叶诱导愈伤组织再生不定芽的方法，可有效解决以芍药外植体诱导愈伤组织污染率高的问题，提高不定芽分化率，增强芽的长势，并且不受季节的影响，可以周年进行培育。

本发明的技术方案如下：

一种通过芍药子叶诱导愈伤组织再生不定芽的方法，其主要步骤是：

1)芍药种胚启动培养：将种子消毒后进行切割，接种到以ms固体培养基为基本培养基，添加赤霉素0.5mg·l^-1，进行常规培养，培养时间15d得到胚苗；

2)芍药组培苗壮苗培养：将胚苗转接入以ms固体培养基为基本培养基，添加赤霉素0.5mg·l^-1，6-苄氨基嘌呤0.5mg·l^-1，激动素0.5mg·l^-1，常规培养20-30d得到生长健壮的组培苗；

3)愈伤组织诱导：将组培苗的子叶从根部切下，接种到愈伤组织培养基，愈伤组织培养基以改良的1/2ms固体培养基为基本培养基，添加噻苯隆0.5mg·l^-1，2,4-二氯苯氧乙酸0.2mg·l^-1，聚乙烯吡咯烷酮1g·l^-1，培养时间45-60d，得到饱满鲜绿、结构紧密的愈伤组织块；

4)不定芽分化培养：将愈伤组织块接入不定芽分化培养基，不定芽培养基以改良的1/2ms固体培养基为基本培养基，添加噻苯隆0.2mg·l^-1，萘乙酸0.5mg·l^-1，聚乙烯吡咯烷酮1g·l^-1，培养时间45-60d。

上述方案中，所述的改良1/2ms固体培养基的配方为：大量元素改良为nh4no3412.5mg·l^-1、kno3475mg·l^-1、cacl2·2h2o220mg·l^-1、mgso4·7h2o185mg·l^-1、kh2po4350mg·l^-1，其他微量元素、铁盐、有机成分含量不变。

上述方案中，所述的种子消毒的具体方法是：将芍药种子置于流水下冲洗干净，剥除种皮，在超净工作台用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗一次，用灭菌滤纸吸干种子表面水分，再用0.1％hgcl2浸泡5min，无菌水冲洗3～5遍，灭菌滤纸吸干种子表面水分，获得消毒后的种子。

上述方案中，所述的芍药种子的母本为粉玉奴、父本为粉玉楼。

上述方案中，所述的常规培养条件是：温度25±2℃，光照时间12h·d^-1，光照强度1200±100lx。

本发明的有益效果为：取材方便，利用种子作为外植体培养的组培苗，不受季节限制，可周年取材，且初代胚培养污染率远低于其他外植体；以种子作为外植体培养的组培苗的子叶作为诱导愈伤组织的材料，细胞分裂活跃，生长旺盛，愈伤组织诱导率高，可达90%以上，不定芽分化率提高至50%以上，且不定芽的长势旺盛；愈伤组织诱导及不定芽分化阶段，添加抗褐化剂，有效抑制褐化问题，提高了工作效率，可有效解决以芍药外植体诱导愈伤组织污染率高的问题。

附图说明

图1是芍药种胚萌发。

图2是胚培养获得的组培苗。

图3是子叶开始膨大。

图4是愈伤组织形成。

图5是愈伤组织分化不定芽。

图6是不定芽成苗。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

1.取材：2016年8月下旬于沈阳农业大学芍药圃收获的芍药杂交种子，种子的母本品种为粉玉奴，父本品种为粉玉楼，均为芍药常见品种。

2.种子消毒及接种：

（1）清洗：流水冲洗种子10~20min，洗净表面尘土；

（2）浸种：挑选饱满粒大的种子，浸泡24~48h，使种皮软化，利于剥离种皮；

（3）去除种皮：用手术刀从种子侧面切割，剥离种皮，在取材时由于芍药种胚嫩小、难以完整剥离，极易损伤，可以保留胚周围少量胚乳，此方法操作方便，不会损伤胚，且对种胚萌发影响较小；

（4）将去除种皮的芍药种子于超净工作台进行消毒，先用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗1次，灭菌滤纸吸干表面水分，再用0.1%升汞浸泡消毒5min，无菌水冲洗3~5次，灭菌滤纸吸干表面水分；

（5）将消毒后的种子接种到用于胚培养的培养基，为防止交叉污染，每瓶接种一个种胚，共接种200瓶。

3.组培苗培养：

（1）胚启动培养基：ms基本培养基，添加赤霉素0.5mg·l^-1，附加蔗糖30g·l^-1，琼脂6g·l^-1，ph为5.8；

（2）组培苗壮苗培养基：ms基本培养基，添加赤霉素0.5mg·l^-1，6-苄氨基嘌呤1.0mg·l^-1。

4.愈伤组织诱导：

（1）植物材料：将组培苗子叶从基部切下，再切成0.5cm×0.5cm大小的子叶块，每瓶接种2块子叶，共接种200瓶；

（2）培养基配方：改良的1/2ms固体培养基为基本培养基，具体是将ms培养基中的大量元素改良为nh4no3412.5mg·l^-1、kno3475mg·l^-1、cacl2·2h2o220mg·l^-1、mgso4·7h2o185mg·l^-1、kh2po4350mg·l^-1，其他微量元素、铁盐、有机成分含量不变；添加噻苯隆0.5mg·l^-1，2,4-二氯苯氧乙酸0.2mg·l^-1，聚乙烯吡咯烷酮1g·l^-1，附加蔗糖30g·l^-1，琼脂6.0g·l^-1，ph为5.8；

（3）培养条件：温度25±2℃，光照时间12h·d^-1，光照强度1200±100lx，培养时间60d。

5.不定芽分化：

（1）将诱导出来饱满鲜绿、结构紧密的愈伤组织块接入不定芽分化培养基，每瓶接种2块愈伤组织，共接种200瓶；

（2）培养基配方：改良的1/2ms固体培养基为基本培养基，具体是将ms培养基中的大量元素改良为nh4no3412.5mg·l^-1、kno3475mg·l^-1、cacl2·2h2o220mg·l^-1、mgso4·7h2o185mg·l^-1、kh2po4350mg·l^-1，其他微量元素、铁盐、有机成分含量不变；添加噻苯隆0.2mg·l^-1，萘乙酸0.5mg·l^-1，聚乙烯吡咯烷酮1g·l^-1，附加蔗糖30g·l^-1，琼脂6.0g·l^-1，ph为5.8；

（3）培养条件：温度25±2℃，光照时间12h·d^-1，光照强度1200±100lx，培养时间60d。

6.统计指标及方法：

（1）将消毒好的种胚接入胚启动培养基，培养15d后统计萌发率和污染率；

萌发率=萌发的种胚数/接种的种胚总数×100%；

污染率=污染的种胚数/接种的种胚总数×100%；

（2）将子叶接入愈伤组织诱导培养基中，培养60d后统计出愈率和褐化率；

出愈率=形成愈伤组织的子叶数/接种子叶总数×100%；

褐化率=褐化的愈伤组织数/接种子叶总数×100%；

（3）将愈伤组织转接入不定芽分化培养基中培养60d后统计不定芽分化率；

芽分化率=分化出芽的愈伤组织数/接入愈伤组织总数×100%。

7.结果：将种胚转接于胚启动培养基中，7d观察到种胚萌发，15d种胚子叶张开（见图1），调查种胚萌发率为74.5％，污染率为0.8%；转入组培苗壮苗培养基，30d可观察到培苗子叶转为嫩绿色，培苗生根（见图2）；将子叶块接种于愈伤组织诱导培养基中，30-60d可以观察到子叶膨大，形成愈伤组织（见图3，图4），调查愈伤组织诱导率为93.5%，褐化率为3.5%；转入愈伤组织分化培养基，30-60d可以观察到芽点，愈伤组织分化出的不定芽，不定芽成苗（见图5，图6），不定芽分化率56.5％。